髓樣細胞是腫瘤微環(huán)境 （TME） 中最豐富的免疫細胞，人們對治療靶向它們的抗腫瘤作用非常感興趣。TAM密度的增加與某些癌癥臨床結(jié)果的改善相關(guān)，通過阻斷 CD47-SIRPα 軸增強 TAM 吞噬活性介導(dǎo)幾種臨床前模型中的抗腫瘤作用。CD47-SIRPα軸阻斷劑的臨床試驗表明，當與其他藥物聯(lián)合使用時，在某些液體腫瘤中具有抗腫瘤活性，但缺乏單藥活性或在實體癌中的臨床證據(jù)。因此，盡管付出了廣泛的努力，但缺乏針對 TAM 以獲得臨床益處的治療方法。過繼轉(zhuǎn)移的T細胞和旨在阻斷CD47-SIRPα軸的藥物是有前途的癌癥療法，可以激活免疫系統(tǒng)的不同分支。但抗CD47 抗體與過繼轉(zhuǎn)移的 T 細胞聯(lián)合使用，由于巨噬細胞介導(dǎo)的了 CAR-T 細胞的快速清除，并未觀察到明顯的治療益處。
(Crystal L Mackall 醫(yī)學(xué)博士是斯坦福癌細胞治療中心的創(chuàng)始主任、斯坦福癌癥研究所副所長和癌癥免疫治療項目負責(zé)人。2022年被評為美國癌癥研究協(xié)會院士與美國國家醫(yī)學(xué)院院士。她的工作主要才基礎(chǔ)免疫學(xué)出發(fā)，主要關(guān)注兒童癌癥。她領(lǐng)導(dǎo)了許多首次人體和兒童臨床試驗，涵蓋樹突狀細胞疫苗、細胞因子以及使用 NK 細胞和轉(zhuǎn)基因 T 細胞的過繼免疫療法。)近日，美國斯坦福大學(xué)斯坦福癌癥研究所癌細胞治療中心的Crystal L Mackall院士團隊報道了一種工程化CD47表達CAR-T細胞療法。這種 CD47 變體 CD47(Q31P)(47E)與 SIRPα 結(jié)合并提供“不要吃我”信號，該信號不會被抗 CD47 抗體阻斷。表達 47E 的 TCR 或 CAR T 細胞在用抗CD47 抗體治療后對巨噬細胞清除具有抵抗力，并介導(dǎo)大量、持續(xù)的巨噬細胞募集到腫瘤微環(huán)境。盡管許多募集的巨噬細胞表現(xiàn)出 M2 樣特征，但聯(lián)合治療協(xié)同仍增強了抗腫瘤療效。巨噬細胞被確定為 T 細胞持續(xù)性的主要調(diào)節(jié)因子，并指明將 T 細胞定向療法與巨噬細胞激活療法相結(jié)合的根本挑戰(zhàn)。工程化 CD47 提供了一種能夠同時利用 T 細胞和巨噬細胞的抗腫瘤作用的治療方法，增強了對實體瘤的殺傷效力。抗 CD47 消除 CAR T 和 TCR T 細胞療效：為了驗證通過 CD47 阻斷增強巨噬細胞吞噬作用可以提高 CAR T 細胞療法療效的假設(shè)，將 HER2-BBζ CAR T 細胞和/或抗 CD47 單克隆抗體 B6H12對 143B 骨肉瘤荷瘤小鼠進行治療。單獨使用CAR T細胞誘導(dǎo)抗腫瘤作用，但添加抗CD47抗體消除CAR T細胞功效。為了研究雙重治療治療失敗的原因，定量B7H3-BBζ CAR T 細胞 ± B6H12 治療后荷瘤小鼠的人 T 細胞。B7H3-BBζ CAR T細胞加B6H12治療小鼠的腫瘤和血液中完全不存在人T細胞，但僅用CAR T細胞治療的小鼠中存在。抗CD47抗體可誘導(dǎo)過繼轉(zhuǎn)移的T細胞快速耗竭，包括那些被設(shè)計為表達轉(zhuǎn)基因TCR或具有不同靶向和共刺激結(jié)構(gòu)域的CAR細胞。圖1 抗CD47抗體通過巨噬細胞介導(dǎo)的T細胞耗竭消除過繼轉(zhuǎn)移的T細胞功效CD47 對 CAR T 細胞的存續(xù)至關(guān)重要：確定 T 細胞消融是否通過 FcR 介導(dǎo)的抗體依賴性吞噬作用發(fā)生，使用CV-1，一種與 CD47 結(jié)合但不與FcR 結(jié)合的融合蛋白。與 B6H12 的結(jié)果類似，CV-1 消除了 CD19 CAR T 細胞對Nalm6-fLuc小鼠的抗腫瘤功效，并誘導(dǎo)接近完全 T 細胞耗竭。使用 CRISPR-Cas9 敲除 CD47 來測試過繼轉(zhuǎn)移 T 細胞的存活是否需要 CD47 表達。47WT型CAR T 細胞在 Nalm6-fLuc 小鼠中擴增并介導(dǎo)了強大的腫瘤控制并顯著延長了生存期，而47KO CAR T細胞耗盡，沒有抗腫瘤活性。（CD47 的過表達）47OE 與體內(nèi)對照組相比，CD19-28ζ CAR T 細胞介導(dǎo)的長期抗腫瘤療效明顯更好，T 細胞存續(xù)更好。總而言之，過繼轉(zhuǎn)移 T 細胞的存活需要 CD47 表達和SIRPα 參與，并且 CD47 過表達增強了 CAR T 細胞的持久性和療效，即使在沒有 CD47 阻斷劑和沒有免疫排斥的情況下也是如此。驗證巨噬細胞在介導(dǎo)抗CD47誘導(dǎo)的T細胞耗竭中的作用。在 B6H12 給藥之前，進行巨噬細胞耗盡，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞耗竭小鼠的 CAR T 細胞數(shù)量顯著升高，即使在沒有 CD47 阻斷的情況下也是如此。巨噬細胞確定為過繼轉(zhuǎn)移的 T 細胞植入和抗腫瘤功效的障礙。進一步解釋了將抗CD47與過繼性T細胞療法相結(jié)合是徒勞的，并暗示巨噬細胞介導(dǎo)的吞噬作用是T細胞在體內(nèi)存續(xù)的重要調(diào)節(jié)因子。研究原代人巨噬細胞在體外吞噬原代人T細胞的潛力。轉(zhuǎn)導(dǎo)表達CAR的T細胞被吞噬水平明顯高于正常T細胞，且B6H12給藥進一步增加吞噬水平。巨噬細胞吞噬作用受“吃我”信號的平衡調(diào)節(jié)，例如鈣網(wǎng)蛋白7，以及“不要吃我”信號，例如 CD47。CD47在CD4和CD8 T細胞之間以及T細胞分化狀態(tài)間的表達相對均勻，但CD47在培養(yǎng)物中的表達隨時間推移而降低，而鈣網(wǎng)蛋白表達在同一時期增加。這解釋了老化的CAR T細胞更容易受到吞噬作用。從接受商業(yè) CD19-28ζ CAR T 細胞治療的患者身上收集的腦脊液 （CSF） 的常規(guī)細胞學(xué)分析顯示，組織細胞吞噬淋巴細胞，與巨噬細胞介導(dǎo)的吞噬作用一致。為了更系統(tǒng)地解決這種可能性，分析了從最近兩項 axi-cel 臨床研究中收集的單細胞 RNA 測序 （scRNA-seq） 數(shù)據(jù)。兩個數(shù)據(jù)集都證明了骨髓細胞中存在CAR mRNA，與巨噬細胞介導(dǎo)的人類CAR T細胞吞噬作用一致。這些數(shù)據(jù)提供了進一步的證據(jù)來支持骨髓細胞吞噬CAR T細胞，因此可能限制過繼轉(zhuǎn)移細胞的持久植入或活化T細胞在臨床環(huán)境中的存活。圖2 巨噬細胞吞噬CAR T細胞在體外和患者體內(nèi)基于上述研究，抗CD47介導(dǎo)的T細胞耗竭可以作為一種現(xiàn)成的安全開關(guān)來減輕CAR T細胞的毒性。為了測試這一點，使用一種多特異性整合素結(jié)合肽（PIP）CAR，靶向在多種惡性腫瘤中表達的整合素16。PIP CAR T細胞在體外介導(dǎo)了有效的活性，但用PIP CAR T細胞治療的載骨肉瘤小鼠表現(xiàn)出急性毒性。即使在非荷瘤小鼠中，用PIP-28ζ CAR T細胞治療也很快導(dǎo)致毒性。相比之下，聯(lián)合B6H12 的 PIP-28ζ CAR T 細胞治療沒有表現(xiàn)出任何明顯的毒性或體重減輕，包括血液中沒有檢測到的人類細胞因子。在異種移植模型中，CAR T 細胞存續(xù)延長可導(dǎo)致移植物抗宿主病 （GvHD）。為了確定抗 CD47 治療是否可以持續(xù)預(yù)防 GvHD，監(jiān)測用 CD19-BBζ CAR T 細胞治療的 Nalm6 小鼠。48 天后，觀察到用CD19-BBζ CAR T 細胞治療的小鼠出現(xiàn) GvHD，表現(xiàn)為脫發(fā)和體重減輕，而用 CAR T 細胞聯(lián)合 B6H12 治療的小鼠沒有發(fā)生 GvHD。這些數(shù)據(jù)表明，CD47阻斷有望作為消除CAR-T細胞相關(guān)毒性的現(xiàn)成安全開關(guān)，嚴格的急性毒性模型和慢性CAR T細胞毒性模型的挽救證明了這一點。工程 CD47 不與抗 CD47 結(jié)合：為了通過 CD47 阻斷誘導(dǎo)選擇性腫瘤吞噬作用，同時保護 T 細胞免受吞噬作用，作者團隊試圖設(shè)計一種 CD47 變體，該變體可拒絕抗 CD47 結(jié)合但保留 SIRPα 相互作用。使用FACS對酵母顯示的 CD47 突變變體庫進行六次連續(xù)分選，在針對 B6H12 的陰性分選和針對 CV-1 的陽性。最終分類中的所有變體都包含單個A30P（CD47（A30P））或Q31P（CD47（Q31P））點突變。當在酵母上顯示為具有游離CD47 N末端的單個CD47變體時，表現(xiàn)出不與 B6H12 的結(jié)合，但保留了與 CV-1 和 SIRPα 正常或增強的結(jié)合。CD47的BC環(huán)突變，特別是Ala30和Gln31，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)保留SIRPα結(jié)合，但免于與多種抗CD47單克隆抗體結(jié)合，為設(shè)計“不要吃我”信號CD47變體的能力提供了概念證明。這些變體不會被抗CD47單克隆抗體阻斷， 這將驅(qū)動腫瘤特異性吞噬作用，同時保留 TME 中的 T 細胞。接下來，測量人類供體巨噬細胞對47KO Jurkat細胞的吞噬作用，這些細胞被改造為表達CD47WT、CD47（A30P）或CD47（Q31P）。在多個供體中，在B6H12與任一變體孵育后，巨噬細胞介導(dǎo)的吞噬作用顯著降低，但與CD47（Q31P）相比，CD47（A30P）提供的保護較少，CD47（Q31P）完全阻止了B6H12孵育后的額外吞噬作用。基于這一結(jié)論，繼續(xù)研究CD47（Q31P）即47E（工程化CD47）。圖4 CD47 的工程變體保留與 SIRPα 的結(jié)合，但不再與抗 CD47 抗體結(jié)合將CFSE 標記的 HER2-BBζ CAR T 細胞被瘤內(nèi)注射到原位腫瘤中，腫瘤樣本顯示巨噬細胞浸潤明顯，而B6H12治療后CAR T細胞減少和CFSE巨噬細胞增加的趨勢。接下來用47WT或47E HER2-BBζCAR T細胞處理143B荷瘤小鼠，B6H12不影響47E-CAR T細胞受體中的TME巨噬細胞水平，但顯著降低了47WT-CAR T中的巨噬細胞水平。通過scRNA-seq分析證實，CAR T細胞和巨噬細胞腫瘤浸潤高度相關(guān)，這與CAR T淋巴細胞將巨噬細胞募集到腫瘤中的模型一致，并且巨噬細胞的募集取決于CAR T在腫瘤中的存續(xù)。47WT和47E CAR T細胞scRNA-seq圖譜顯示T細胞表達顯著表達TNF、IFNG、CCL3、CCL4、CCL5、CSF1和CSF2，它們共同吸引和激活單核細胞和巨噬細胞，并與T細胞介導(dǎo)的巨噬細胞募集到腫瘤中有關(guān)。在接受或不接受B6H12治療的情況下，47E CAR T細胞治療的基因表達基本上沒有變化。而與接受47WT CAR T與B6H12聯(lián)合治療相比，接受47E CART與B6H12聯(lián)合治療TME中的T細胞顯示出595個差異表達基因（DEG），包括增加的促炎基因集，如IL-12、CD40/CD40L和NF-κB信號傳導(dǎo)。這些數(shù)據(jù)為47E-CAR T細胞TME內(nèi)的髓細胞和T細胞之間的實質(zhì)性串擾提供了證據(jù)。接下來評估47WT或47E T細胞加抗CD47治療在多種腫瘤模型中的抗腫瘤作用。在143B中，CAR T細胞和抗CD47療法作為單一療法的效果最小。用B6H12處理后，47WT CAR T細胞完全耗盡，而47E CAR T淋巴細胞持續(xù)數(shù)周。只有B6H12加47E-CART細胞誘導(dǎo)腫瘤生長的顯著延遲和總生存率的提高。在轉(zhuǎn)移性神經(jīng)母細胞瘤中，將B6H12與47WT和47E B7H3-BBζCAR T細胞配對，并觀察到47E CAR T淋巴細胞加B6H12增強了持久性和提高了抗腫瘤療效。在患有Nalm6-fLuc白血病的小鼠中，47E與47WT CD19-28ζCART細胞加B6H12增強了抗腫瘤功效。這些數(shù)據(jù)表明，CD47阻斷與表達47E的治療性T細胞配對可保護T細胞免受巨噬細胞介導(dǎo)的吞噬作用，并導(dǎo)致巨噬細胞在TME內(nèi)大量持續(xù)流入，這與T細胞-巨噬細胞的串擾有關(guān)。其結(jié)果是在實體、液體和轉(zhuǎn)移性腫瘤中具有強大的抗腫瘤協(xié)同作用。圖5 47ET 細胞療法加抗 CD47 治療通過招募不同的巨噬細胞群來增強抗腫瘤功效先前的研究報告稱，CD47是防止免疫排斥所必需的。CD47 過表達與 MHC 敲除相結(jié)合使CAR T 細胞對抗同種異體免疫排斥反應(yīng)。但是作者團隊研究結(jié)果表明，即使在沒有免疫排斥反應(yīng)的情況下，CD47也是過繼轉(zhuǎn)移T細胞存活所必需的，CD47過表達可提高CAR T細胞的存續(xù)和療效。NSG小鼠中的抗CD47處理誘導(dǎo)巨噬細胞介導(dǎo)的過繼轉(zhuǎn)移T細胞的快速和完全耗竭。其反應(yīng)足夠快速和有效，足以在致命的CAR T細胞毒性模型中介導(dǎo)完全保護，這可能具有立竿見影實現(xiàn)臨床受益。這些結(jié)果與數(shù)據(jù)一致，表明CD47敲除CAR T細胞在異種移植模型中被迅速清除，以及觀察到 Cd47 和 Sirpa 敲除小鼠的總淋巴細胞和抗原特異性淋巴細胞減少、感染易感性增加和自身免疫易感性降低。盡管CD47阻斷大大增強了T細胞耗竭，但即使在沒有CD47-SIRPα阻斷的情況下，巨噬細胞吞噬作用也限制了過繼轉(zhuǎn)移的T細胞的持久性。臨床scRNA-seq數(shù)據(jù)也發(fā)現(xiàn)了髓系細胞內(nèi)的CAR mRNA。總之，這些發(fā)現(xiàn)與巨噬細胞吞噬作用在調(diào)節(jié)T細胞穩(wěn)態(tài)中起重要作用的模型一致。在長時間培養(yǎng)后，T細胞上“吃我”信號的表達增加，CD47的表達減少，提出了CD47-SIRPα軸可能類似地調(diào)節(jié)衰老T細胞清除率的前景。未來的研究需要更好地定義T細胞活化和分化、促吞噬和抗吞噬受體的表達以及吞噬作用敏感性之間的關(guān)系。作者團隊觀察到CAR T細胞誘導(dǎo)巨噬細胞快速涌入腫瘤，巨噬細胞的持續(xù)募集取決于CAR T細胞的存續(xù)。結(jié)果，47ECAR T細胞受體在TME中表現(xiàn)出髓樣細胞和T細胞之間的廣泛串擾，包括T細胞中IL-12、CD40L和NF-κB信號傳導(dǎo)的誘導(dǎo)。因此，47E保護 T 細胞免受 CD47 介導(dǎo)的吞噬作用，同時增強腫瘤吞噬作用、抗原呈遞和誘導(dǎo)促炎性 TME。需要更多的研究來測試 47E在完全免疫功能正常的系統(tǒng)中，以了解對其他免疫細胞類型的影響，包括內(nèi)源性 T 細胞和自然殺傷細胞。雖然 B6H12 是一種研究級抗體，但本研究中產(chǎn)生的 CD47 變體也對抗了與臨床級抗體 TJC4（lemzoparlimab）的結(jié)合，這將預(yù)測 47E可以將過繼療法與臨床級抗 CD47 抗體配對。Sean A Yamada-Hunter, Johanna Theruvath, Brianna J McIntosh, et al. Engineered CD47 protects T cells for enhanced antitumour immunity. Nature. 2024 May 15.https://www.nature.com/articles/s41586-024-07443-8
