特別說明：本文由米測技術中心原創撰寫，旨在分享相關科研知識。因學識有限，難免有所疏漏和錯誤，請讀者批判性閱讀，也懇請大方之家批評指正。
原創丨米測MeLab
編輯丨風云
研究背景
2022年塑料產量達到 4 億噸，其中包裝和一次性塑料占了很大一部分。產生的廢物最終被填埋、焚燒或排放到環境中，造成環境污染。轉向可生物降解和可堆肥的塑料越來越多地被視為一種有效的廢物管理替代方案。聚乳酸 (PLA) 被普遍認為是一種可生物降解的聚合物。2022年，PLA占生物塑料市場的 20.7%（46 萬噸），由于大規模的工業投資，預計到 2027 年這一比例將迅速增長到 37.9%（240 萬噸）。
關鍵問題
然而，PLA的生物降解主要存在以下問題：
1、PLA在家庭堆肥和土壤條件下的生物降解率仍然很低
盡管 PLA 被普遍且誤導性地認為是一種可生物降解的聚合物，但它僅在溫度高于 60°C 的工業堆肥條件下才能有效降解，它在自然環境（如土壤和水環境）和家庭堆肥中的溫和條件下表現出非常低的生物降解性。
2、開發一種可在自然環境中自降解的 PLA 材料具有應用前景
土壤微生物可以同化PLA降解釋放的小低聚物和單體， 因此開發一種可在自然環境中自降解的 PLA 材料可以減輕一次性塑料廢物的積累。在塑料材料中嵌入解聚酶是一種創新方法，但主要限制因素是酶活性不足以及將粉末狀酶引入 PLA 的過程，這阻礙了其在薄包裝中的使用。
新思路
有鑒于此，圖盧茲大學A. Marty、I. André等人介紹了一種基于PLA的塑料，其中嵌入了優化的酶，以確保在室溫下快速生物降解和可堆肥，且使用可擴展的工業工藝。首先，通過基于結構的合理工程設計一種新的超熱穩定PLA水解酶，實現了80倍的活性增強。其次，通過基于母料的熔融擠出工藝將酶均勻分散在 PLA 基質中。通過 70°C下熔融擠出，將液態酶配方加入低熔點聚合物聚己內酯中，形成“酶化”聚己內酯母料。母料顆粒在 160°C 下通過熔融擠出與 PLA 結合，產生酶化 PLA 薄膜（0.02% w/w 酶），該薄膜在家庭堆肥條件下在20-24周內完全分解，符合家庭堆肥標準。酶化薄膜的機械和降解性能與工業包裝應用兼容，并且在長期儲存期間保持完好無損。這種創新材料不僅為堆肥和生物甲烷生產開辟了新途徑，還為PLA降解提供了可行的工業解決方案。
技術方案：
1、表征了PLAase性能
作者從嗜熱菌中提取了PLA解聚酶PAM，新發現的PAM酶在高溫和堿性條件下，PLA解聚性能優于蛋白酶K，但需優化以適應近中性pH。
2、研究了基于結構的 PAM PLAase 工程
通過高分辨率X射線衍射技術，解析了PAM蛋白結構，并通過分子模擬和實驗證實了改良變體PAMFLI顯著提升PLA解聚效率和穩定性。
3、開發了結構工程策略將耐熱蛋白T作為新的PLAase支架
作者通過結構工程策略，發現超熱穩定 PLA 解聚酶 ProteinTFLTIER，活性和熱穩定性顯著提升。
4、探究了酶解PLA材料的生物降解性
作者討論了ProteinTFLTIER 酶變體在生產酶化聚合物中的應用，證實了ProteinTFLTIER 酶變體顯著提升 PLA 聚合物的生物降解性和環保處理潛力。
技術優勢：
1、開發了可擴展且經濟高效的熔融擠出工藝
作者開發了一種可擴展且經濟高效的熔融擠出工藝，以酶促 PLA 基聚合物生產可自降解的材料。這種創新需要一種高效的熱穩定酶，能夠在 PLA 中混合后在 160°C 左右保持其活性。
2、成功分離并純化了一種新的PLA解聚酶
作者從嗜熱菌 Actinomadura keratinilytica T16-1 中成功分離并純化了一種新的PLA解聚酶 (PLAase)，通過全RNA測序和N端測序，確定了編碼 386個氨基酸多肽的全長RNA，其活性依賴于 N 端前結構域的裂解。
技術細節
PLAase性能表征
新發現的PLA解聚酶PAM從嗜熱菌中提取，在大腸桿菌中生產并純化。研究比較了大腸桿菌生產的pro-PAM與蛋白酶K在不同pH和溫度條件下的PLA解聚性能。與蛋白酶K相比，PAM 在家庭堆肥條件下表現更優，尤其在高溫和 pH 9.0 下，解聚率可達 96%，而蛋白酶 K 僅為 18%。但PAM在pH 7.5和28°C時活性顯著降低，表明需進一步優化其在近中性pH條件下的性能。
圖 PLA解聚酶PAM優于蛋白酶K
基于結構的 PAM PLAase 工程
通過高分辨率X射線衍射技術，確定了PAM蛋白的三維結構，揭示了其催化機制。利用分子動力學模擬和位點飽和誘變技術，優化了PAM的PLA解聚性能。改良的PAMFLI變體在pH 7.5和9.0下表現出顯著提高的比活性，尤其在pH 7.5下，比活性在28°C和45°C下分別提高了6倍和4.5倍。在45°C和pH 7.5下24小時內，PAMFLI實現了90%的PLA解聚，而天然PAM僅20%。優化后的PAMFLI不僅提高了PLA解聚效率，還保持了與PAM相同的熱穩定性，顯示了其在工業應用中的潛力。
圖 PAM PLAase的結構洞察
圖 位點飽和誘變提高PAM對PLA的解聚活性
耐熱蛋白T作為新的PLAase支架
作者通過結構工程策略，從超嗜熱細菌中發現了一種超熱穩定 PLA 解聚酶 ProteinTFLTIER。通過將 PAMFLI 的催化特性轉移到 ProteinT，顯著提升了其 PLA 解聚活性和熱穩定性。ProteinTFLTIER 在 pH 7.5 下比活性比 ProteinT 高 35 至 80 倍，在 45°C 下24小時 PLA 轉化率達 89%。其 Tm 值高達 79.4°C，比 PAMFLI 高 21.6°C，顯示了其在家庭堆肥應用中的潛力。ProteinTFLTIER 在不同 pH 和溫度條件下均表現出穩定的活性，適合在家庭堆肥環境中使用。
圖 ProteinT和aqualysin-I與PAM PLAase的PLA解聚性能比較
圖 耐熱 ProteinT的PLA解聚活性提高
酶解PLA材料的生物降解性
ProteinTFLTIER 酶變體通過液體酶制劑的形式被引入 PLA 聚合物，顯著提高了其生物降解性。這種酶制劑不僅改善了酶在聚合物中的分散性，還通過母料方法和阿拉伯膠保護提高了酶的穩定性。在水生物降解測試中，ProteinTFLTIER 薄膜在高溫和高 pH 條件下表現出優異的降解能力。此外，該薄膜在家庭堆肥和工業堆肥條件下均顯示出良好的崩解和生物降解特性。嵌入ProteinTFLTIER生產的PLA基材料可以通過厭氧消化設施處理以產生生物甲烷。值得注意的是，使用PLA + MBs + ProteinTFLTIER 薄膜，23 天內碳轉化率達到 91%，而無酶 PLA + MBs 薄膜對照在孵育30天后未觀察到生物降解，該策略為塑料廢棄物的環保處理提供了新的可能性。
圖 酶解PLA材料的水性生物降解性得到改善
圖 在家庭堆肥條件下，PLA 薄膜的分解是由ProteinTFLTIE的加入引發的
展望
總之，作者通過從自然多樣性中尋找PLAase候選物，然后使用計算機輔助工程策略提高其活性，從嗜熱菌中分離出的兩種天然 PLAase，即 PAM 和 ProteinT，被鑒定并進一步工程化，以提高它們在 pH 7.5 和 45°C 下的 PLA 解聚活性。PLA + MBs + ProteinTFLTIER薄膜表現出良好的水生物降解性能，在家庭堆肥條件下，培養20至24周后完全分解。此外，薄膜的機械性能和生物降解性均在18個月的儲存期內保持良好，證明了酶解材料的耐久性和穩定性。酶解 PLA 材料進一步表明符合工業堆肥要求，因為 PLA?+?MBs?+?ProteinTFLTIER 薄膜在不到一個月的時間內就完全生物降解，而無酶PLA?+?MBs薄膜對照則需要3個多月的時間。
參考文獻：
Guicherd, M., Ben Khaled, M., Guéroult, M. et al. An engineered enzyme embedded into PLA to make self-biodegradable plastic. Nature (2024).
https://doi.org/10.1038/s41586-024-07709-1
