第一作者：李茂霖
趙惠民教授，現任美國伊利諾伊大學厄本那-香檳分校（UIUC）化學與生物分子工程系Steven L. Miller講座教授，美國NSF人工智能分子合成研究所主任，美國化學會ACS Synthetic Biology期刊主編。趙教授予1992年取得中國科學技術大學生物學學士學位；1998年在諾貝爾化學獎獲得者Frances Arnold教授的指導下，獲得加州理工學院化學博士學位。此后，在美國陶氏化學公司擔任工業生物技術實驗室項目負責人；2000年加入UIUC獨立開展研究，2008年晉升為正教授。趙教授作為蛋白質工程與合成生物學領域的先驅之一，主要研究興趣是開發和應用合成生物學、機器學習和實驗室自動化工具，解決健康、能源和可持續發展等領域的重大挑戰。趙教授在Nature、Science、Nature Chemistry、Nature Biotechnology、Nature Catalysis、Chemical Reviews等國際期刊發表論文440余篇，申請專利30余項，受邀495次大會報告、主題演講和特邀演講。趙教授培養的學生和博士后中，有37位成為了國內外知名院所的教授或首席研究員，為我國的生物催化與合成生物學領域培養了一大批優秀的青年人才。趙教授曾獲AAAS Fellow、AIMBE Fellow、AIChE Daniel I.C. Wang獎、AIChE FP&B分會獎、ECI酶工程獎、ACS Marvin Johnson獎和SIMB Charles Thom獎等諸多榮譽。 能夠催化氟化物反應的酶非常罕見，這導致生物合成技術制備藥物、農藥、材料學等領域常用的氟化物非常困難。有鑒于此，伊利諾伊大學厄本那-香檳分校趙惠民教授等開發了光酶催化技術，實現了烯烴的不對稱氫氟烷基化。光誘導黃素依賴性烯還原酶（flavin-dependent ene-reductases）的混雜酶能夠從氟碘烷烴產生碳自由基，并且通過光酶誘導進行烯烴的立體選擇性氟官能團化。通過氟化結構和酶之間的相互作用實現立體結構控制，能夠在氟烷基的β、γ、δ位點立體化學方式進行酶催化氫原子轉移（這個過程對于化學催化轉化反應非常困難）。這項研究為開展含氟化合物的酶催化轉化技術以及氟化物的不對稱催化轉化提供幫助。通常化學催化反應能夠處理各種氟化物（氟甲基、二氟甲基、氧三氟甲基、巰基-三氟甲基）的反應，但是化學催化的問題在于難以利用遠離立體結構中心的氟官能團實現更高的立體選擇性。產生這個問題的原因在于，氟化結構難以與催化劑之間產生強相互作用，使得催化劑的手性無法傳播到催化位點偏遠的位置。酶催化劑的本征結構使得其能夠與氟化官能團之間產生多種相互作用，在活性位點附近產生遍布分散的手性環境，因此有助于解決遠離活性中心位置手性的困難。此外，人們發現光酶催化能夠拓展酶催化的應用和反應場景。黃素單核苷酸（FMN，flavin mononucleotide）還原酶能夠通過立體選擇性HAT反應控制前手性碳中心自由基，FMN酶通過對反應物的光生電子轉移，提高反應物的能量，使得反應物處于不穩定狀態，隨后釋放離去基團，形成自由基并捕獲自由基。作者首先挑選合適的氟化試劑，發現具有合適的離去基團的氟化試劑通過光酶催化反應產生含氟的碳中心自由基。隨后含氟自由基被烯烴捕獲，通過酶HAT實現在分子上安裝遠程立體碳原子。這種設計能夠在分子內的β、γ、δ遠端位點引入立體中心，該過程通過化學催化反應無法實現。 FMN還原酶通常容易與含有豐富羰基、氰基、硝基官能團的反應物結合，一些研究結果顯示FMN混雜酶能夠與含有吡啶結構或者磺酰基結構的反應物結合進行光酶催化。通過利用這種混雜性特點，作者研究了有可能與FMN兼容的氟化物。 使用巴氏酵母（Saccharomyces pastorianus）的OYE1作為催化劑，使用α-甲基苯乙烯作為自由基接受分子，篩選氟化物。此外篩選的時候通過GDH-NADP+-Glu體系循環產生NADPH。研究發現，2-吡啶磺酰氟（PyFluor）、甲苯磺酸三氟甲基酯（TFMT）、三氟甲磺酸乙酯（TFETf）沒有反應活性，Togni II試劑具有一定活性（產率<10 %）。但是作者發現三氟碘乙烷是比較合適的氟化物，能夠以20 %的產率生成γ手性位點，立體選擇性達到92 % ee。隨后，結合以往的研究，優化改善氟化試劑的反應活性。研究不同的FMN酶的反應活性，并且改變可見光、添加劑、溶劑等反應條件，發現野生老黃酶（OYE3）是最合適的催化劑，產率達到80 %，立體選擇性達到93 % ee。在相同反應條件下，對比的OYE1酶的反應產率僅為65 %，立體選擇性為92 % ee。控制實驗結果顯示，對于該反應，酶、光、GDH都是必不可少的。使用各種α-甲基乙烯基芳烴作為烯烴反應物，發現三氟碘乙烷（TFIE）是合適的氟化試劑。對于含有各種官能團的反應物，該反應能夠以中等或較高的收率進行反應（收率：37~99 %），很好的立體選擇性（69~99 % ee）（化合物1-13）。對于各種含烯基的芳烴（呋喃、噻吩、苯并二惡英和吡啶）同樣表現高產率（49-99 %）和較高的立體選擇性（88-99 % ee）（化合物14-17）。作者發現電子濃度更高的烯烴對于缺電子三氟乙基自由基的親和性更強，因此具有更高的反應活性。該反應對于α-乙基苯乙烯（18）的反應性較差，說明反應受到α-烷基的立體位阻的影響。拓展氟化物反應物的種類。使用多氟碘烷修飾β-立體中心，能夠以31-84 %的收率和90-98 % ee立體選擇性生成目標產物（化合物19-26）。使用多氟亞甲基碘化物作為原料，能夠安裝γ-立體中心，產率達到42-80 %，立體選擇性達到92-99 % ee（化合物27-30）。當氟官能團和碘之間含有兩個亞甲基的氟反應物，能夠安裝δ-立體中心。控制反應顯示，野生黃酶OYE1和OYE3的反應活性較差，不僅產率低，而且立體選擇性只有70 % ee。反應性能降低的原因主要有兩點：氟原子數目少導致與酶之間的相互作用更小，氟官能團與自由基中心的距離變化導致降低自由基親和性。 為了解決OYE1和OYE3的低反應活性，使用定向誘變技術改善光酶催化劑，使用1,1-二氟-2-碘乙烷和α甲基苯乙烯作為反應物，通過結構對接給出活性位點的氨基酸基團的低能量構象。發現增加N194側鏈的大小能夠顯著改善產率和ee。OYE3_N194Y變體的產率能夠提高至65 %，而且ee選擇性仍達到87 %。通過分子對接（molecular docking）和集群建模（cluster modeling）研究反應機理。作者將關鍵酪氨酸基團（Y375、Y196和Y82）突變為苯丙氨酸。發現減少酪氨酸基團導致降低反應活性，其中，OYE1_N194Y的反應產率達到82 %，立體選擇性達到91 % ee，而且當使用OYE3_N194Y作為催化劑甚至達到等物質的量的產率。這些研究結果說明絡氨酸基團能夠非常好的調節底物-酶之間的相互作用，與理論計算的預期結果相符。 通過同位素標記實驗研究不對稱HAT反應機理。在Glu-GDH-NADP+體系，D-葡萄糖-1,2,3,4,5,6,6-d7作為反應物（非氘代的檸檬酸鹽緩沖液），并且使用氘代FMNhq。通過理論計算研究親核進攻步驟和HAT步驟。其中雙自由基IntA作為起始的中間體，隨后非結合的α-甲基苯乙烯與三氟乙基自由基反應生成IntB。IntB中間體隨后在自由基進攻形成IntC。最后從FMNsq得到氫原子生成最終產物。HAT步驟包括兩個自由基發生結合，電子自旋從三線態變成單線態。在這項研究，作者發展了FMN光酶用于烯基芳烴安裝氟化官能團，從而填補了自然界酶催化的空白。使用FMN還原酶的反應活性，并且結合FMN還原酶能夠形成限域環境用于HAT，實現了化學催化反應難以得到的反應效果。通過理論計算研究揭示酶和氟化底物之間的相互作用，弄清了產生立體選擇性的原因。這項工作拓展了酶催化氟化的方法，有助于精確選擇性安裝不對稱結構的氟官能團。Maolin Li et al., Asymmetric photoenzymatic incorporation of fluorinated motifs into olefins. Science 385,416-421(2024). DOI: 10.1126/science.adk8464https://www.science.org/doi/10.1126/science.adk8464
