化學反應在特定隔室中的物理分離是細胞代謝的標志。模塊化酶，如蛋白酶體，通過在按順序組織的特殊催化結構域中處理底物來執行復雜的任務。受這些自然機器的啟發，人造生物室已被實現在細胞和無細胞環境中重建和操縱代謝途徑。雖然大多數系統依賴于基于蛋白質和脂質的構建塊的周期性自組裝，但基于核酸的方法，特別是DNA折紙方法，能夠為每個核堿基制造可編程形狀和已知空間坐標的三維（3D）結構。這允許以亞納米精度對折紙表面進行功能化。此外，還開發了模塊化裝配程序，以指導將多個結構有序地組合成微米級的大型裝配。總之，這些特征已被用于研究空間限制和分子間距離對單個酶或酶對活性的影響。為了模擬天然模塊化酶的復雜性，一個重要的挑戰是控制多個反應的順序。
成果簡介
鑒于此，德國杜伊斯堡-埃森大學B. Saccà、H. Meyer等研究人員利用DNA的可編程性來設計一個具有多催化功能的模塊化和分區化結構。
該人工嵌合體將蛋白質分離和解折疊過程與下游的蛋白水解反應相結合，從而產生26S蛋白酶體的半合成原型：一種自區室化和解折疊酶輔助的蛋白質降解機器。通過精確控制化學計量、空間排列和解折疊機的單向取向，該設計提供了一種底物特異性的網關機制，用于調節底物進入、解折疊和加工到下游蛋白水解模塊。研究人員發現，雖然空間限制提高了每個催化步驟的速率，但模塊的物理連接進一步提高了級聯的整體性能，并最大限度地減少了脫靶相互作用。最后，通過修改下游模塊的活性，研究人員為不同的任務重新編程嵌合體，展示了該方法在選定底物上工程生物催化途徑的潛在用途。
研究數據顯示，雖然空間限制將單個反應的速率提高了十倍，但將分隔的酶物理連接成嵌合體有效地將這兩種反應結合起來，并將脫靶蛋白水解減少了近六倍。因此，該模塊化方法可以作為設計人工納米工廠的藍圖，這些工廠具有重塑的催化性能和功能，超出了在自然系統中觀察到的。
模塊化酶的納米級模型
該模塊化嵌合體反應由兩個主要步驟組成：首先由細胞穩態、增殖和信號傳導中具有重要作用的valosin-containing protein (VCP)/p97催化，它是一種蛋白質解折疊機器；其次是α-胰蛋白酶(aCt)催化，這是一種S1家族中研究廣泛且穩定的絲氨酸蛋白酶。作為ATP酶，p97由兩個六聚體環(D1和D2)組成，中間有一個狹窄的通道，N端結構域附著在D1環上，C端尾部附著在D2環上。在細胞內，p97招募泛素化底物蛋白，為它們在蛋白酶體中的降解做準備，或者以一種不依賴泛素的方式將底物蛋白定向回收。研究人員體外重建了一個不依賴泛素的分離和解折疊途徑，并將其作為模型的上游反應。具體來說，抑制劑-3 (I3)底物與PP1和SDS22輔因子結合形成SP-I3復合物，通過適配蛋白p37直接被p97招募。添加ATP后，I3解折疊并與結合伙伴分離。
為了有效地將底物解折疊與蛋白水解消化相結合，p97機器必須足夠接近aCt，但又必須物理上分離以防止非特異性蛋白水解。這可以通過首先將每種酶固定在適當的隔室中實現，然后將兩個不同裝載的隔室連接成一個嵌合體。隔室應允許封裝單個p97蛋白，同時允許其機械運動和足夠的結合伙伴空間，這對于p97的正確功能至關重要。隔室還應允許控制性裝載胰蛋白酶，并實施模塊化組裝策略。最后，由于底物穿行反應嚴格單向，即從p97的N端到C端，需要滿足兩個關鍵條件：(1) p97孔必須與DNA隔室的中心軸線對齊，以確保解折疊的底物無阻礙地轉移到蛋白水解模塊；(2) p97在DNA隔室內的相對方向必須已知并唯一定義，以確保所有構建物具有相同的N到C的底物轉移方向。
圖| 一個模塊化的納米級分區模型
模塊化艙室的設計和組裝
研究人員設計了一種DNA折紙結構（Nemesis, NE），它是一個25 nm寬、41 nm高、53 nm長的六角形空心棱柱，由兩個相同的部分（Narcissus (N) 和 Echo (E)）通過核苷酸堿基互補連接而成。這個結構旨在匹配p97的大小和形狀，同時確保有足夠的空間供其與蛋白伙伴結合和無阻礙的機械運動。為了簡化，研究人員將修改后的NE隔室稱為“A”或“B”，分別代表上游和下游模塊，后面跟著上標表示蓋子的數量（例如AL表示一個蓋子，A2L表示兩個蓋子）。隔室內腔的功能化通過帶有單鏈突出臂（PA）進行，用下標表示（例如APA）。整個嵌合體將被命名為AB。
圖| DNA折紙艙室的設計和表征
解折疊機器的空間限制
研究人員設計了一種DNA折紙結構，通過將p97蛋白與熒光標記的DNA手柄結合，成功地將p97蛋白封裝進DNA隔室。通過原子力顯微鏡和透射電子顯微鏡驗證了p97蛋白與DNA隔室的結合，并且發現p97蛋白在隔室內主要呈現一種特定的方向，即N端結構域指向外部。冷凍電鏡數據進一步證實了這種定向，顯示p97蛋白與DNA隔室的中心軸線共軸對齊。這種設計不僅實現了p97蛋白在隔室內的特定定位，還為底物提供了一個單向的轉移通道，解決了系統的主要結構挑戰。
圖| p97機器的封裝
底物在上游模塊中解折疊
作者研究了DNA隔室化對p97蛋白活性的影響。通過將底物I3與光活化蛋白mEos融合，研究人員能夠監測p97解折疊底物的過程。實驗中，研究人員使用了不同的DNA隔室，并通過熒光變化來追蹤底物的解折疊。作者發現，當p97被限制在DNA隔室內時，其解折疊底物的速率顯著提高。特別是，當隔室上游空間受限時，解折疊速率進一步增加。此外，多室結構中附加的空腔室也能加速解折疊反應。這些結果表明，空間限制可以提高p97的活性，可能通過增加局部底物濃度或提高蛋白質的構象穩定性。通過優化隔室設計，研究人員可以進一步提升p97的解折疊效率。
下游模塊中的蛋白質降解
研究人員通過將α-胰蛋白酶(aCt)共價修飾上帶有熒光的單鏈DNA，成功制備了酶-DNA共軛物，并將其固定在DNA折紙隔室中。實驗顯示，這種固定化顯著提高了aCt的催化效率，尤其是在隔室內含有更多PA臂時。此外，研究人員對SP–I3mEos復合物進行了蛋白水解實驗，發現I3部分容易被降解，而mEos部分則較抗蛋白酶。計劃通過在p97解折疊后立即進行蛋白水解來提高效率。
圖| DNA分區對酶活性的影響
模塊化嵌合體使底物解折疊和降解
研究人員測試了DNA隔室對不同分子的滲透性，發現小分子如寡核苷酸和α-胰蛋白酶可以進入，但大于45 kDa的蛋白則不能。這表明該隔室可以有效限制大分子復合物。研究人員進一步將p97解折疊模塊與α-胰蛋白酶蛋白水解模塊連接，構建了一個完整的底物解折疊和降解途徑。通過瓊脂糖凝膠電泳和透射電子顯微鏡成像，研究人員確認了模塊的成功組裝和功能。實驗顯示，將α-胰蛋白酶固定在DNA隔室內可以顯著提高其催化效率，并減少自我降解。通過質譜分析，研究人員發現連接α-胰蛋白酶模塊可以提高底物降解的效率。這些結果表明，模塊化設計在提高酶活性和控制反應過程中具有顯著優勢。
圖| DNA折紙嵌合體的組裝和催化功能
設計底物特異性生物催化途徑
為擴展該方法的應用范圍，研究人員將p97驅動的解折疊過程與由Src（一種在胚胎發育和細胞生長調節中起作用的酪氨酸激酶）催化的磷酸化過程相耦合。研究人員期望通過這種人工設計的生物催化級聯反應，增加底物解折疊后才能暴露的酪氨酸殘基的磷酸化程度。
研究人員利用模塊化組裝獲得了A(p97)/B(Src)嵌合體，并分析了在有無先前解折疊的情況下底物磷酸化的程度。結果顯示，在添加ATP后，兩種情況下都發生了底物磷酸化。然而，當兩個酶模塊按預定的順序物理連接時，I3mEos上磷酸化酪氨酸殘基的數量顯著增加。這證明了以底物特異性方式發生的解折疊輔助磷酸化，并展示了該方法在對幾乎所有I3標記蛋白執行翻譯后修飾方面的通用性。
小結
研究人員設計了一種新型模塊化酶，模擬26S蛋白酶體的功能，能識別、解折疊并消化特定底物。這種設計克服了傳統DNA限制酶的局限，允許p97酶在有限空間內自由活動并正確定向。通過I3結構域，研究人員實現了對底物的特異性識別，這為在不同底物上進行定制化修改提供了可能。
盡管該系統對小于45 kDa的分子仍有滲透性，可能影響反應效率，但研究人員正在研究通過二氧化硅和共聚物涂層來降低這種滲透性。未來，研究人員計劃增加半滲透屏障和刺激響應功能，以更精細地控制反應流程和分子的進出，從而推動新型生物催化途徑的發展，創造具有超越自然系統能力的微型實驗室。
參考文獻：
Huang, J., Jaekel, A., van den Boom, J. et al. A modular DNA origami nanocompartment for engineering a cell-free, protein unfolding and degradation pathway. Nat. Nanotechnol. (2024).
https://doi.org/10.1038/s41565-024-01738-7
