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1. Nature Nanotechnology：DNA折紙，賦能人工納米工廠！
為了預防癌癥和病毒感染，T 細胞受體 (TCR) 會主動掃描靶細胞表面，尋求識別由主要組織相容性復合體 (pMHC) 呈遞的異常肽。值得注意的是，TCR 對抗原表現出極高的特異性和敏感性。單個細胞上約10萬個正常 pMHC 中，即使有一兩個異常pMHC分子也足以觸發 T 細胞活化。導致如此強烈 T 細胞反應的分子機制仍未完全了解。然而，一種新興假設表明，細胞-細胞連接動態環境中的TCR-pMHC鍵會受到機械力的作用，這些力會導致 TCR-pMHC 復合物發生構象變化，從而延長鍵壽命并暴露激酶對接位點，以促進 TCR 信號傳導所必需的后續磷酸化級聯。事實上，使用單分子力技術的研究表明，~10 pN 的力會觸發鈣通量，這是 T 細胞活化的標志。然而，這些力是從外部施加到 pMHC-TCR 鍵上的，因此，人們不禁要問，這些力的大小和持續時間是否代表了天然免疫連接。這凸顯了開發工具來量化膜間連接處 TCR 機械轉導的必要性。
分子張力傳感器 (MTS) 之前已開發出來，用于檢測傳輸到單個受體-配體鍵上的力。簡而言之，彈性分子（DNA 發夾、肽或聚合物）用熒光共振能量轉移 (FRET) 對進行修飾，并錨定在一個末端的表面，并在其另一端呈現配體以結合感興趣的受體。傳輸到探針的細胞力使其延伸并分離 FRET 對，從而導致熒光增強。利用這種傳感器，研究人員發現 TCR 向抗原傳遞 10-20?pN的力，這些力有助于抗原識別、TCR 信號傳導和細胞毒性脫粒。然而，在這些研究中，傳感器被固定在硬玻璃載玻片上，限制了橫向運動，這與細胞膜的情況不同。這種固定方式會抑制 TCR 聚集和集中，可能導致力的大小被高估。幾項研究使用玻璃支撐的脂質雙層 (SLB)來模擬質膜，并將 MTS 插入 SLB 上。然而，在 TCR 簇內，MTS 可能位于足夠近的位置，以引起 FRET 對 (分子間 FRET) 之間的串擾。這會導致熒光發射受到抑制，從而影響測量，并可能解釋先前各個研究小組報告的 TCR 力的大小之間的差異。此外，平面 SLB 缺乏可變形性并呈現扁平拓撲結構，從而導致平坦且連續的 T 細胞/SLB 接觸區。相比之下，生理 T 細胞-靶細胞接觸是高度動態的，以零星和彎曲的相互作用為特征，通常涉及微絨毛或侵入體狀突起。此外，玻璃的剛度比質膜高 109 倍，先前的研究表明，T 細胞機械轉導受基質剛度的影響。
成果簡介
鑒于此，埃默里大學Khalid Salaita等人開發了膜束縛 DNA 折紙張力傳感器 (DNA origami tension sensors, DOTS) 來解決這些限制。
DNA 折紙由于其高度的可編程性和功能性，已成為制造用于空間圖案化、傳感和分子操控的納米器件的一種通用方法，并為力傳感器設計提供了強大的平臺。具體來說，研究人員制作了矩形納米片折紙，上面帶有對 TCR 力有反應的 DNA 發夾。折紙的尺寸將相鄰發夾之間的最小距離設置為 40?nm，從而完全抑制了 FRET 對之間的串擾。使用比率熒光強度以及基于熒光壽命的成像，研究人員發現 TCR-抗原鍵在流體界面處受到超過 8?pN 的力，這些力受多種因素調節，包括膜流動性、細胞骨架和蛋白質排斥力。為了最好地模擬抗原呈遞細胞的幾何形狀并重建免疫突觸的三維結構，研究人員將 DOTS 連接到 SLB 功能化微粒上，這樣就可以使用流式細胞術以高通量方式測量懸浮狀態下的 TCR 力，從而為基于機械的抗原篩選提供潛在工具。最后，研究人員將 DOTS 錨定到活 B 細胞膜上，從而創建了第一個可以量化真實免疫細胞-細胞連接處力的分子裝置。
DOTS 的設計和表征
研究人員設計了一種尺寸為40 nm x 80 nm的單層DNA折紙納米結構DOTS，通過92個單鏈DNA支架與p7560噬菌體DNA骨架雜交形成。DOTS整合了帶有熒光團-猝滅劑對的DNA發夾序列，用于檢測T細胞受體（TCR）力。通過凝膠電泳和原子力顯微鏡（AFM）確認了DOTS的完整性和結構。DOTS在不同孵育條件下表現出高穩定性，并可通過DNA-膽固醇相互作用錨定到支撐脂質雙層（SLB）表面。在5nM濃度下，DOTS在SLB表面的密度達到214個分子/μm2，并表現出生理水平的側向流動性，通過熒光恢復后光漂白（FRAP）測量得到擴散系數約為0.04 μm2s?1。與之前報道的超生理流動性的MTS不同，DOTS沒有表現出異常的流動性。此外，DOTS由于尺寸較大，相鄰折紙之間的最近距離超過40 nm，是Forster半徑的六倍，有效消除了分子間的FRET效應。在10nM濃度下，SLB表面飽和且未觀察到FRET信號，與在相似密度下觀察到13.3% FRET指數的MTS形成對比。
圖1 | DOTS的表征
DOTS 檢測液體膜間界面的 TCR 張力
作者研究了OT-1轉基因小鼠的未激活CD8+ T細胞與pMHC負載的DOTS和ICAM-1涂層的SLB的相互作用。T細胞擴展時，大多數DOTS被排斥，少數與TCR結合并在細胞-SLB連接處聚集。ICAM-1與LFA-1結合，形成類似天然免疫突觸的受體分布。DNA發夾替換DOTS后，排斥率降低，表明DOTS排斥可能與蛋白質和折紙的側向擁擠有關。缺乏抗原的DOTS也被排斥，但不中心化。T細胞的微絨毛可能物理排斥DOTS，這一點通過TIRF顯微鏡成像得到證實。單分子成像顯示，自由DOTS迅速從細胞粘附區移出，少數DOTS在細胞連接處與TCR結合并中心化，形成cSMAC。通過FLIM測量，研究人員發現在TCR簇中，Cy3B DOTS的熒光壽命沒有變化，表明DOTS之間沒有發生FRET，而MTS則表現出明顯的FRET效應。
圖2 | T細胞與DOTS包被的流體SLB的動態相互作用
隨后，研究人員利用DOTS通過監測其DNA發夾的機械展開來檢測TCR力量。TCR力量通常不足以剪切DNA，但足以展開發夾。他們設計了不同GC含量的發夾，以檢測不同力量。通過比率分析，量化了TCR-pMHC相互作用產生的張力信號。使用鎖定鏈技術，研究人員能夠在細胞-表面接觸期間積累并鎖定TCR-抗原張力。FLIM分析證實了機械展開的發夾在T細胞-SLB連接處的積累。通過調整發夾的GC含量，研究人員發現TCR-pMHC鍵經歷的力量大多在11.7 pN到15.6 pN之間。研究人員還使用張力計鏈(TGT)來進一步驗證這一點，發現12 pN TGT在免疫突觸形成時的DOTS積累較弱，表明TCR力量足以破裂較弱的TGT。在非流體SLB上，研究人員觀察到DOTS沒有聚集或排斥，且添加鎖定鏈后熒光增強，表明TCR在抗原固定時經歷正常和側向拉力。效應T細胞與未激活T細胞相比，雖然也能展開DOTS，但產生的張力信號較弱，這可能與效應T細胞的細胞骨架動力學和TCR耦合的差異有關。
圖3 | TCR向側向流動的抗原傳遞機械力量
TCR 力量的來源
研究人員通過藥物處理T細胞來研究細胞骨架在TCR力量產生中的作用。發現抑制肌球蛋白II ATPase的Blebbistatin未引起力量信號的顯著變化，而針對肌動蛋白的藥物CK666和Latrunculin-B顯著降低了力量信號。CK666還抑制了TCR信號傳導，表明肌動蛋白是TCR機械轉導的主要途徑。TCR激活前，TCR與肌動蛋白耦合較弱，研究人員探討了初次抗原接觸時力量的來源。通過調整抗原的高度，研究人員發現張力信號和TCR信號傳導隨抗原高度的增加而降低，這與TCR-pMHC復合物因尺寸不匹配而產生的膜彎曲和機械應變的預測一致，為TCR作為機械傳感器提供了支持。
圖4 | F-肌動蛋白和膜彎曲對TCR力量生成的貢獻
用于研究 TCR 力學的球形支撐脂質雙層
研究人員開發了一種球形支撐脂質雙層（SSLB）平臺，用于在非平面結構上測量T細胞受體（TCR）的力量。通過在微粒上涂覆SLB并固定DOTS，研究人員觀察到TCR與DOTS在結合處的相互作用和張力信號。利用流式細胞儀，研究人員能夠高通量地分析TCR力量，區分單個T細胞、單個SSLB和它們之間的結合體。通過改變肽配體，研究人員展示了SSLB平臺在抗原篩選中的潛力，證明了TCR-抗原張力信號對激動劑抗原具有高度特異性。
圖5 | 用于研究懸浮液中TCR力學的球形支撐脂質雙層
生理性 T 細胞–B 細胞連接處的 TCR 張力
研究人員將DNA折紙結構DOTS錨定在目標細胞膜上，以研究細胞間結合處的力量。通過改進錨定策略，研究人員克服了細胞膜擁擠的問題，并成功在多種細胞系上均勻錨定DOTS。在與T細胞的相互作用中，DOTS展示的抗CD3ε和pMHC抗原在結合處積累，并通過熒光比率變化反映了TCR的力量。未使用鎖定鏈時，觀察到微弱的熒光比率變化，而加入鎖定鏈后，比率顯著增加，表明TCR能傳遞超過8 pN的力量。
流式細胞儀分析進一步證實了在免疫細胞結合處存在顯著的機械事件，這些事件的特征受TCR配體的親和力調節。特別是，pMHC-DOTS在加入鎖定鏈后顯示出更大的熒光強度變化，與TCR-pMHC相互作用的特性一致。這些結果證明了DOTS作為一種工具，能夠在接近生理條件下測量和分析細胞間力量傳遞的潛力。
圖6 | T細胞-B細胞界面上的TCR力量
小結
在這項研究中，研究人員展示了DOTS作為一種強大的工具，用于研究T細胞的機械轉導。研究人員證實了T細胞能夠在流體SLB上和原生細胞-細胞結合處傳遞力量給其抗原。與固定在玻璃滑片上的類似發夾傳感器測量到的力量相比，流體結合處內部的力量更加短暫且頻率更低。這一點通過需要使用鎖定策略來量化TCR力量顯而易見。這可能是因為TCR力量包括一個在側向流體界面上高度衰減的側向“剪切”向量，膜上抗原的較低密度，以及抗原“剛度”與T細胞牽引力之間眾所周知的關系。
需要注意的是DOTS的局限性。首先，量化的張力信號代表了細胞機械事件的累積“歷史”。在TCR-pMHC測量的背景下，這意味著張力信號取決于T細胞細胞骨架的機械活動、與TCR的結合以及TCR的拷貝數。張力信號還對DOTS在表面上的密度和張力報告熒光團的猝滅敏感。將DOTS系縛到活細胞上存在挑戰，可能是因為細胞表面龐大的糖萼，需要使用調節抗原高度的長橋鏈，從而相應地改變張力信號。
鑒于DOTS提供了一種定量工具來詢問原始免疫細胞，這種策略可能會發現多種其他應用。
1）其中一種應用涉及表征面臨特定抗原挑戰的T細胞克隆的生物物理屬性。DNA折紙的高度可編程性也使其能夠通過簡單的DNA雜交來納入不同的配體，如PD-1、CD2、LFA-1和CTLA，以研究受體之間的機械通信。
2）DOTS還可以控制配體之間的距離，從而可能研究配體空間組織與T細胞機械激活之間的關系。
3）另一個潛在的應用是在單分子分析TCR-抗原機械動力學方面，這可能允許測量加載率和力量壽命。實現這一目標需要提高DOTS的信噪比，這可能需要額外的熒光報告器。
參考文獻：
Hu, Y., Rogers, J., Duan, Y. et al. Quantifying T cell receptor mechanics at membrane junctions using DNA origami tension sensors. Nat. Nanotechnol. (2024).
https://doi.org/10.1038/s41565-024-01723-0
