楊揚教授&劉鵬教授，今年已發表了一篇Nature，兩篇Nature Chemistry，一篇Nature Synthesis不對稱催化去芳基化能夠將平面的芳基化合物轉化為立體結構明確的三維分子結構的有效方法學，有鑒于此，加州大學圣巴巴拉分校楊揚教授、匹斯堡大學劉鵬教授等報道發展了一種新型（new-to-nature）金屬催化-生物催化體系，實現了酶催化以自由基方式進行不對稱去芳構化。在這項工作中，作者使用定向進化的技術得到新型自由基去芳構化酶P450rad1-P450rad5，實現了對廣泛的芳基化合物進行不對稱去芳構化，反應兼容的底物包括吲哚、吡咯、酚等，反應能夠以立體匯聚的方式和立體發散的方式進行自由基去芳構化，得到優異的酶催化控制能力。理論計算研究發現工程化的金屬酶與反應中間體之間的氫鍵相互作用對于增強酶催化活性和立體選擇性的重要作用。此外，作者發現非離子表面活性劑能夠顯著促進生物轉化反應速率，為生物轉化反應效率低的問題提供了解決方案。圖2. 金屬氧化還原-酶不對稱催化雜環芳烴自由基脫芳構化由于吲哚雜環化合物廣泛應用于醫藥、農藥、功能材料等領域，因此作者對生物催化吲哚自由基脫芳構化進行研究。使用α-溴酰胺修飾的吲哚1a作為反應物，測試了以往工作中進行工程化設計的CYP102A1變體（P450BM3）和工程化的P450自由基環化酶的催化活性。使用96孔板以高通量實驗的方式以攜帶P450變體的完整大腸桿菌細胞進行生物催化性能的初篩。篩選發現許多變體能夠生成去芳構化的螺環結構產物2a，這種產物含有相鄰的四級碳原子，但是大多數反應的產物是消旋的。比如，P450自由基環化酶P450ATRCase1和P450arc1能夠分別以35 %和38 %的產率生成2a，產物的立體選擇性為53:47 e.r.。隨后，作者驚喜的發現之前發現的卡賓轉移酶P411-VACtrans（P1）能夠以34 %的產率和53:47 e.r.立體選擇性2a產物。而且進一步作者發現，當加入抗壞血酸鈉，在沒有細胞的方式下進行酶催化能夠得到類似的產率，同時得到提高的立體選擇性（83:17 e.r.）。 使用P1作為起始，隨后通過酶定向進化的方式改善P450自由基脫芳構酶的立體選擇性和催化活性。通過AutoDock軟件進行分子對接實驗，并且對關鍵的活性位點基團進行靶向設計，進行迭代位點誘變和篩選。在每輪次的定向進化過程中，得到4種酶的分子庫，使用96孔板進行測試和篩選。篩選后發現三個有益的突變，L181V, A78C, F437A，得到 P411-CIS A78C V87L L181V P248T I263G F437A酶，將這些酶命名為P450rad1。整個細胞形式的生物催化劑P450rad1的催化活性改善了2倍，立體選擇性顯著得到增強，得到82 %的產率和91:9 e.r.立體選擇性。當不在細胞內的P450rad1作為酶催化劑，能夠以90 %的產率和97:3 e.r.的立體選擇性生成2a。使用這種吲哚脫芳構化酶P450rad1研究反應兼容的吲哚底物分子。在5位點含有供電子官能團的吲哚，比如甲氧基（2a）、甲基（2b）具有非常好的反應性，得到優異的產率和立體選擇性。反應同樣能夠兼容一些缺電子的官能團，比如氟（2d）、氯（2e）、溴（2f）。而且對于2、4、5、6、7位點含有取代基的吲哚都能夠非常好的進行脫芳構化轉化（2g-2j）。其中，修飾4-甲基（2g）和7-甲基的反應物同樣得到優異的立體選擇性，但是由于位阻效應導致產率有些減少。對于4-甲基吲哚（2g），使用變體 P1 A78C L181V (P450rad1 A437F)能夠得到比P450rad1稍微更高的立體選擇性（95:5 e.r.）。吡咯立體發散脫芳構酶P450rad2和P450rad3 圖3.P450rad1，P450rad2，P450rad3的發現，進化，底物兼容性開發的金屬酶催化體系能夠應用于吡咯d氨雜環化合物的自由基脫芳構化。其中P411-CIS L75A L181A能夠以93 %的產率和85:15 e.r.立體選擇性生成(R)-4a，P411Diane2 W263I G268A P327T V328A能夠以93 %的產率和10:90 e.r.立體選擇性生成(S)-4a。隨后通過誘變和篩選，得到的 P450rad2和P450rad3 具有更好的立體選擇性，分別能夠生成94 %的產率和91:9 e.r.的(R)-4a，以76 %的產率和8:92 e.r.立體選擇性生成(S)-4a。其中P450rad3的TON達到3230±10。作者進一步拓展了生物催化自由基脫芳構化反應對電子富集的芳烴兼容。特別關注2-溴-1,3-雙羰基化合物(5)的自由基脫芳構化。因為該反應能夠生成含有兩個連續四級碳立體中心位點的產物。通過對 P450arc1 L266H G438T L78C (‘P2’)進行誘變和篩選，得到P450rad4，能夠以98 %的產率和94:6 e.r.立體選擇性將5a轉化為6a，實現了非常罕見的對應匯聚自由基脫芳構化轉化的方法。P450rad4能夠對許多酚化合物進行對應匯聚自由基脫芳構化，比如沒有修飾取代基的苯酚（5b），2,6雙官能團取代的苯酚（5a, 5c），修飾酯基（乙基酯(6a-6c)、丙基酯(6d)、丁基酯(6e)）的苯酚。使用起始的P2變體進行立體選擇性催化轉化，能夠以45 %的收率和78:22 e.r.立體選擇性生成立體結構擁擠并含有相鄰四級碳-四級碳的3,5-二甲基修飾的苯酚，能夠以55 %的產率和81:19 d.r.和84:16 e.r.立體選擇性生成6g產物。作者發現膠束效應能夠顯著的加快難以溶解于水溶液的萘酚底物的生物催化轉化反應動力學。作者設想底物在水中的溶解性較低時導致生物催化反應動力學緩慢的原因，而不是酶催化劑活性導致。驗證發現，當使用混合溶劑，能夠改善產率，并且稍微增強立體選擇性。但是這種混合溶劑無法進一步改善反應。作者認為膠束催化劑能夠為溶解性提供普適性的解決方案，因為納米膠束的疏水內核為疏水底物提供非常好的反應環境，因此顯著增加有效濃度。因此，通過選取合適的表面活性劑，能夠維持金屬酶的完整性和催化活性。同時，非離子性表面活性劑能夠避免蛋白質變形，因此非離子性表面活性劑是較好的選擇。隨后選取6個非離子性表面活性劑，發現端基修飾羥基官能團（Brij 30, Brij 35, TPGS-1000）具有比端基甲氧基官能團（Nok, TPGS-750-M）更高的轉化率和產率。而且這種加入表面活性劑的方法能夠將酶催化反應在沒有細胞裂解物的狀態進行，從而能夠改善產率和立體選擇性。 總之，這項研究非常罕見的展示膠束能夠加快生物催化反應動力學，這說明選擇合適的表面活性劑有助于生物催化轉化轉化反應。這項技術有可能應用于其他具有底物溶解性問題的生物催化轉化。劉鵬，本科畢業于北京大學，碩士畢業于加拿大圭爾夫大學，博士畢業于UCLA，現為匹茲堡大學副教授。劉鵬課題組使用計算工具來研究有機和有機金屬反應。研究反應的發生方式，控制速率和選擇性的因素，并提供理論見解，以幫助開發改進催化劑和試劑。楊揚，2011年在北京大學獲得化學學士學位，師從王劍波教授進行本科研究。隨后，他在麻省理工學院獲得有機化學博士學位，師從Stephen Buchwald教授。在麻省理工學院，他的研究重點是銅催化的簡單烯烴的不對稱水官能團化。作為美國國立衛生研究院博士后研究員，楊博士與加州理工學院的Frances Arnold教授（2018年諾貝爾化學獎得主）合作，開發了一種C(sp3)-H鍵不對稱胺化的通用酶催化平臺，目前是美國加州大學圣巴巴拉分校教授。楊揚教授曾獲得攝政青年教師獎學金（2021年）、教師職業發展獎（2022年）、NSF職業獎（2022年）、美國國立衛生研究院最大化研究者研究獎（2022年）、蒂姆化學期刊獎（2023年）、陸軍研究辦公室青年研究員獎（2023年）、帕卡德獎學金（2023年）和斯隆研究獎學金（2024年）。Fu, W., Fu, Y., Zhao, Y. et al. A metalloenzyme platform for catalytic asymmetric radical dearomatization. Nat. Chem. (2024). DOI: 10.1038/s41557-024-01608-8https://www.nature.com/articles/s41557-024-01608-8 Wang, TC., Mai, B.K., Zhang, Z. et al. Stereoselective amino acid synthesis by photobiocatalytic oxidative coupling. Nature 629, 98–104 (2024).DOI:10.1038/s41586-024-07284-5https://www.nature.com/articles/s41586-024-07284-5Ju, S., Li, D., Mai, B.K. et al. Stereodivergent photobiocatalytic radical cyclization through the repurposing and directed evolution of fatty acid photodecarboxylases. Nat. Chem. 16, 1339–1347 (2024).DOI: 10.1038/s41557-024-01494-0https://www.nature.com/articles/s41557-024-01494-0Zhao, LP., Mai, B.K., Cheng, L. et al. Biocatalytic enantioselective C(sp3)–H fluorination enabled by directed evolution of non-haem iron enzymes. Nat. Synth 3, 967–975 (2024).DOI: 10.1038/s44160-024-00536-2https://www.nature.com/articles/s44160-024-00536-2
