生物分子凝聚現象在細胞過程中的作用越來越受到重視，這些過程從信號傳導到應激反應和基因調控等眾多方面都有所涉及。蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）是凝聚核形成、生物分子隔離和生化活動組織的基礎。要闡明生物分子凝聚的功能，不僅需要在亞室水平上了解蛋白質組的空間和時間信息，還需要了解這些在空間上共存的蛋白質之間的相互作用。特別是因為許多蛋白質同時存在于多個亞細胞區域，揭示感興趣的凝聚中特定室的蛋白質相互作用組是非常理想的。鄰近標記方法使用連接的酶（例如，APEX、BioID、TurboID）或活性分子來分析鄰近的生物分子，使得可以對無膜凝聚體如應激顆粒（SG）和P體進行組成分析。然而，由于產生的活性中間體的擴散性質，這些策略不適合直接研究PPI，因為在凝聚環境中不可避免地會包括許多旁觀者蛋白。由于具有高時間分辨率和短交聯半徑，設計了預裝在感興趣蛋白（POI）上的光交聯探針，以捕獲活細胞中直接和瞬時的PPI。位點特異性光交聯劑（例如，DiZPK、Kcr*、o-NBAK、VL1）提供了PPI界面的詳細信息，但在從單個選定位點全面分析凝聚體中的多價相互作用方面存在困難。代謝性整合的光交聯劑（例如，光亮氨酸、光蛋氨酸）能夠實現特定氨基酸殘基的蛋白質組規模替換和PPI網絡的全局固定。盡管這些光交聯劑的短交聯半徑（即0-2納米）和多位點整合適合捕獲直接和多價PPI，但蛋氨酸和亮氨酸在PPI界面的相對低分布限制了這些探針在凝聚體中的實用性。于此，北京大學陳鵬等研究人員報告了一種凝聚增強的、空間導向的、代謝整合輔助的光交聯策略——稱之為DenseMAP——用于在活細胞中的凝聚體中高效和忠實地進行直接和天然蛋白質相互作用組的空間和時間映射。圖|DenseMAP 策略示意圖。δ-光賴氨酸（表示為紅色星號）允許在活細胞中對具有固定標記半徑 (R) 的卡賓活性物質進行全蛋白質組摻入和光控生成。由于生物分子凝聚物內部高度擁擠，殘基接近度增強，相互作用價數（界面/位點）增加，基于 δ-光賴氨酸的光交聯非常適合捕獲和全局分析這些瞬時區室中的直接 PPI。由于許多蛋白質具有多個亞細胞位置，DenseMAP 可以通過將凝聚增強的光交聯與細胞內區室特異性生物素標記相結合來捕獲凝聚物特異性蛋白質相互作用組。此外，當應用于核仁中的亞區室特異性支架蛋白（如 NPM1）時，DenseMAP 可以揭示直接相互作用組，從而揭示整個蛋白質組及其感興趣的亞區室的動態變化。捕獲的相互作用組可以通過鏈霉親和素 (SA) 或抗體 (Ab) 進行富集，并通過質譜 (MS) 進行鑒定。DenseMAP依賴于優化的光賴氨酸探針，顯示出對各種支架或客戶蛋白的廣泛適用性。通過進一步與生物素連接酶（BirA）導向的蛋白質標記和定量蛋白質組學相結合，研究人員獲得了特定室的蛋白質相互作用組，揭示了SARS-CoV-2的核蛋白（N）的SG特異性相互作用組，并揭示了病毒-宿主競爭期間磷酸化的功能性作用。圖|DenseMAP 揭示了 SARS-CoV-2 N 蛋白與 SG 特異性相互作用的磷調控此外，DenseMAP使得YTHDF1和YTHDF2這兩個RNA-m6A閱讀器的SG特異性相互作用組的比較分析成為可能。最后，通過捕獲亞室支架蛋白NPM1的直接相互作用組，DenseMAP揭示了核仁中顆粒組分（GC）的特定蛋白質組，從而闡明了SUMOylation（SUMO，小泛素樣修飾物）在蛋白質質量控制中的關鍵作用。總體而言，DenseMAP有助于深入理解亞細胞和亞室凝聚體中蛋白質相互作用組的功能和調控。圖|SUMO 化對核仁質量控制和 C9orf72 多聚 GR 重復序列誘導的損傷的影響總之，該研究開發了一種名為DenseMAP的策略，它基于優化的光交聯劑，用于生物分子凝聚體中蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）的空間和時間映射。該δ-光賴氨酸與先前報道的γ-光賴氨酸相比，二氮雜環部分更接近側鏈的末端，可能帶來更高的交聯效率。短交聯半徑約為1 nm，多位點整合和擁擠環境共同產生了DenseMAP的凝聚增強特性，使其適合在凝聚體背景下直接捕獲相互作用組。DenseMAP對蛋白質的天然狀態（如翻譯后修飾）的干擾最小，可以通過分鐘級的光交聯研究無膜細胞器的動態變化。DenseMAP提供了一個在凝聚體中進行PPI網絡分析的平臺，具有廣泛的適用性和與化學蛋白質組學的兼容性。通過彌合蛋白質相互作用與亞細胞位置或翻譯后修飾之間的差距，DenseMAP揭示了凝聚體中獨特的調控機制，這可能為在生理和病理條件下操縱無膜細胞器的組裝或物質交換提供了一條途徑。結合不同的蛋白質標記和富集手段，DenseMAP可以擴展到探索PPIs與凝聚體中其他功能蛋白方面的相互作用，如RNA結合。隨著質譜技術的進步，DenseMAP有潛力剖析凝聚體中的多對多PPI網絡。盡管如此，δ-光賴氨酸與天然賴氨酸之間的輕微結構差異，以及δ-光賴氨酸的有限整合效率，在某些情況下可能會帶來限制。此外，由于它依賴于局部BirA對感興趣蛋白質組的可及性，因此需要先前的知識，即已知在目標凝聚體或亞室中與蛋白質組全局相互作用的“核心”或“支架”蛋白。我們期望我們的DenseMAP策略的設計將激發該領域技術進步的進一步探索。Li, K., Xie, X., Gao, R. et al. Spatiotemporal protein interactome profiling through condensation-enhanced photocrosslinking. Nat. Chem. (2024).https://doi.org/10.1038/s41557-024-01663-1
