多組分反應(yīng)（Multicomponent reaction）是三個反應(yīng)物或者更多反應(yīng)物結(jié)合構(gòu)筑一個產(chǎn)物的反應(yīng)，多組分反應(yīng)能夠快速合成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物，但是對于酶催化劑，多組分反應(yīng)仍然非常罕見。這是因?yàn)槊傅拇呋钚晕稽c(diǎn)通常無法支持多個反應(yīng)物，特別是對于含有多個自由基中間體的反應(yīng)。最近，人們發(fā)展了自由基分選(radical sorting)策略能夠?qū)Χ鄠€反應(yīng)物參與的自由基轉(zhuǎn)化反應(yīng)，但是這種反應(yīng)難以控制立體選擇性。有鑒于此，南京大學(xué)黃小強(qiáng)教授、廈門大學(xué)王斌舉教授等報(bào)道焦磷酸硫胺素依賴酶進(jìn)行定向進(jìn)化，并且結(jié)合光催化劑，實(shí)現(xiàn)了三組分立體選擇性交叉偶聯(lián)。這個反應(yīng)能夠?qū)⑷菀撰@取的三個反應(yīng)物（醛、α-溴羰基化合物、烯烴）轉(zhuǎn)化為立體結(jié)構(gòu)的酮。反應(yīng)機(jī)理揭示光-酶協(xié)同催化體系能夠精確形成三個自由基，構(gòu)成了新型酶催化反應(yīng)。這項(xiàng)反應(yīng)表現(xiàn)了完美的立體選擇性，測試的33個反應(yīng)中，25個反應(yīng)的立體選擇性≥97%。 反應(yīng)發(fā)展和設(shè)計(jì)硫胺素依賴酶（ThDP)是自然界中非常常見的兩電子形成化學(xué)鍵和斷裂化學(xué)鍵。同時，最近人們開發(fā)的化學(xué)催化自由基分選機(jī)理拓展了自由基交叉偶聯(lián)反應(yīng)，但是目前此類過程仍無法進(jìn)行立體選擇性。圖1. 光催化-酶催化反應(yīng)的設(shè)計(jì)作者基于硫胺素依賴酶（ThDP）開發(fā)了一種光/生物協(xié)同催化體系，通過簡單易得原料產(chǎn)生自由基。通過醛分子產(chǎn)生酰基自由基，α-溴羰基化合物產(chǎn)生親電自由基，烯烴作為自由基的受體。利用重組的三組分自由基酶直接合成含有豐富立體結(jié)構(gòu)的有機(jī)酮。 以[1,1′-聯(lián)苯]-4-甲醛（1a）分子產(chǎn)生酰基、苯乙烯（2a）作為烯烴自由基受體、1-溴-2-丙酮（3a）產(chǎn)生親電自由基。使用Ru(bpy)3Cl2作為光催化劑，藍(lán)光（波長450-460nm）LED作為光源，篩選硫胺素依賴酶ThDP，發(fā)現(xiàn)Pseudomonas fluorescens (PfBAL)的苯甲醛裂解酶能夠催化三組分反應(yīng)，但是產(chǎn)率僅為3%，立體選擇性為90% ee（Entry）。這種野生型PfBAL主要面臨的困難是反應(yīng)生成偶姻縮合反應(yīng)產(chǎn)物5a。酶的定向進(jìn)化。通過半理性迭代定點(diǎn)突變策略對野生PfBAL酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)進(jìn)化，得到最優(yōu)結(jié)構(gòu)的變體3CRE-1，能夠以70%的收率和99.5%的立體選擇性生成4a，反應(yīng)的苯偶姻縮合副反應(yīng)選擇性得到非常好的抑制（5% 5a），（Entry 2）。分別通過位點(diǎn)飽和突變、分子動力學(xué)模擬輔助篩選的多輪過程得到3CRE-1變體。控制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ThDP輔酶、光催化劑、可見光是該反應(yīng)必不可少的挑戰(zhàn)。通過酶的定向進(jìn)化，催化反應(yīng)效率顯著提高，TON達(dá)到117。 酰基自由基反應(yīng)物兼容性。對一系列對位芳基/雜芳基取代基的醛，能夠?qū)崿F(xiàn)優(yōu)異的立體選擇性（≥99% ee）（4a-f）。其中對位雜芳基酮（4c-f）是非常有用的過渡金屬催化C-H鍵官能團(tuán)化反應(yīng)物，同時具有弱配位點(diǎn)和強(qiáng)配位點(diǎn)。含有富電子或者缺電子取代基的芳基醛（4g-k）兼容，對鄰位修飾氟官能團(tuán)的氟苯甲醛（4l）、苯并噻吩醛（4m）有良好的兼容性。 烯烴兼容性。該反應(yīng)對許多常見烯烴有著良好的反應(yīng)性，能夠合成立體結(jié)構(gòu)1,5-二酮化合物，對各式各樣的電子結(jié)構(gòu)（4n-q）以及不同位點(diǎn)取代基（4q-s）兼容。這種光生物催化體系兼容許多雜環(huán)烯烴化合物，包括噻吩（4t）、呋喃（4u）、吡啶（4v）等官能團(tuán)，能夠?qū)⒐曹椂N轉(zhuǎn)化為1,7-二酮（4w）。反應(yīng)兼容沒有活化的脂肪族烯烴（4x），表明該反應(yīng)的廣泛應(yīng)用前景。該反應(yīng)兼容許多官能團(tuán)。兼容的官能團(tuán)包括酮（4y-aa）、酯（4ab, 4ae）、腈基（4ac）。使用市售二氟甲基化試劑3g，能夠生成立體結(jié)構(gòu)富集的二氟酮（4ad），反應(yīng)兼容重氮化合物（4ae）。消旋的α-鹵酮能夠生成不同立體比例的二酮（4af, 4ag）。反應(yīng)可進(jìn)行放大量合成，以63%的產(chǎn)率生成4a，以61%的產(chǎn)率生成4b，以36%的產(chǎn)率生成4ab，且放大量沒有影響產(chǎn)物立體選擇性。該反應(yīng)具有優(yōu)異的立體選擇性控制，溫和反應(yīng)條件，對許多官能團(tuán)容忍，這種新型生物催化反應(yīng)顯著拓展了分子的復(fù)雜性。提出了光催化-酶催化協(xié)同催化反應(yīng)。首先硫胺素依賴酶（ThDP）的3CRE變體和1醛分子反應(yīng)生成Breslow中間體（Int. A）。隨后被[Ru]*光催化劑單電子氧化-脫氫生成酰基自由基Int. B，同時還原的[Ru]·-將自由基前體3進(jìn)行單電子還原，生成親電自由基Int. C。隨后Int. C對烯烴分子2自由基加成，生成前手性親核性自由基Int. D，最后在酶催化活性位點(diǎn)發(fā)生化學(xué)選擇性和立體選擇性自由基交叉偶聯(lián)反應(yīng)，生成立體結(jié)構(gòu)的有機(jī)酮。通過實(shí)驗(yàn)和理論計(jì)算驗(yàn)證機(jī)理。通過Stern-Volmer還原淬滅反應(yīng)，說明在只有醛（1a）和酶的體系，發(fā)生還原淬滅[Ru]*。計(jì)算Breslow中間體（Int. A）對[Ru]*的電子轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)電子轉(zhuǎn)移放熱46.4kcal mol-1，在熱力學(xué)上容易發(fā)生。相比的氧化淬滅反應(yīng)為吸熱過程（吸熱21.8kcal mol-1），因此確立光催化反應(yīng)的還原淬滅過程。 通過分子對接和分子動力學(xué)模擬，驗(yàn)證[Ru]能夠通過π-π相互作用，結(jié)合在酶催化活性位點(diǎn)的F283基團(tuán)附近。因此[Ru]和Int. A之間距離靠近，能夠高效率的轉(zhuǎn)移電子和中間體，促進(jìn)三組分自由基反應(yīng)的高效率。高效率的淬滅反應(yīng)同樣驗(yàn)證這個結(jié)論。分子動力學(xué)模擬結(jié)果表明H113基團(tuán)作為堿，對Int. A脫質(zhì)子生成自由基陽離子（Int. A·+），促進(jìn)轉(zhuǎn)化為Int. B。通過量子力學(xué)/分子動力學(xué)（QM/MM）計(jì)算驗(yàn)證Int. A·+容易對H113基團(tuán)轉(zhuǎn)移質(zhì)子（能壘僅為2.1kcal mol-1，反應(yīng)放熱4.5kcal mol-1）。驗(yàn)證[Ru]·-進(jìn)行單電子還原能夠產(chǎn)生Int. C。該反應(yīng)為放熱過程（3.9kcal mol-1），通過室溫DMPO捕獲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行ESR測試，驗(yàn)證生成DMPO/Int. C加合物。在靠近酶催化口袋或者酶催化口袋內(nèi)部生成Int. B和Int. C。通過控制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，生成C(sp2)-C(sp3)的關(guān)鍵步驟在酶活性活性位點(diǎn)進(jìn)行，因此能夠得以保證酶催化劑能夠控制反應(yīng)產(chǎn)物的立體選擇性。Xing, Z., Liu, F., Feng, J. et al. Synergistic photobiocatalysis for enantioselective triple radical sorting. Nature (2024) DOI: 10.1038/s41586-024-08399-5https://www.nature.com/articles/s41586-024-08399-5
