生物粘合劑是自然界中許多生物用于附著、捕食、運動、建造和防御的粘性物質。從細菌生物膜到蝸牛粘液，再到蜱蟲巢和蜘蛛網，這些生物粘合劑的種類繁多。許多動物使用基于蛋白質的粘合劑，例如沙堡蠕蟲建造類似珊瑚的土丘，貽貝通過蛋白線附著，而絲蟲噴射粘液以纏繞獵物。盡管這些生物粘合劑中的一些已經被詳細研究，但許多其他粘合劑的粘附機制仍然知之甚少。其中一個未被探索且獨特的生物粘合劑是由蜱蟲產生的，蜱蟲是一種對公共衛生和經濟具有重要影響的廣泛寄生生物。
蜱蟲是一種通過長時間吸血來寄生在宿主身上的節肢動物，通常硬蜱會持續數天。蜱蟲唾液與宿主的長時間接觸和轉移可能導致病原體傳播，從而引發疾病，如人類的萊姆病和牛的巴貝西病、貧血癥和心水病。為了成功進食，硬蜱蟲分兩個階段附著在宿主身上：初始的機械附著，隨后產生生物粘合劑形成所謂的水泥錐。盡管已經對蜱蟲唾液的生物化學和生物信息學分析揭示了富含甘氨酸的蛋白質（GRPs）在蜱蟲唾液中豐富，但GRPs如何促進這些功能的具體機制仍然未知。
鑒于此，瓦格寧根大學Siddharth Deshpande等人探索了硬蜱蟲物種Ixodes scapularis中的蜱蟲GRP，并系統研究了其蒸發和鹽誘導的液-液相分離（LLPS）、分子相互作用，以及凝聚物老化成類似固體的聚集體以及表現出粘合特性的能力。該發現旨在闡明水泥錐的形成以及唾液GRPs可能的作用，為蜱蟲預防和生物技術應用（如醫用密封劑）提供相關知識。
序列分析表明GRP是一種無序蛋白
研究人員選取了蜱唾液中的一種GRP，其成熟序列tick-GRP77富含甘氨酸（約26%），同時含有大量非極性（約44%）和極性（約36%）氨基酸，疏水（約7%）和芳香族（約9%）殘基相對較少。通過AlphaFold預測，其信號肽為α-螺旋，其余部分無序。IUPred算法及其他算法也證實tick-GRP77為高度無序蛋白。CIDER分析顯示，tick-GRP77序列與許多已知的相分離IDR-包含蛋白相似，這表明它具有很強的LLPS傾向。
圖1：蜱蟲唾液中富含甘氨酸的蛋白質在液-液相分離中表現出固有無序性
蜱蟲GRP77通過簡單凝聚發生LLPS
合成tick-GRP77后，利用液滴蒸發實驗模擬蜱唾液分泌過程。將緩沖后的tick-GRP77溶液（16-500μM）滴在親水玻璃片上，隨著蒸發，液滴邊界處蛋白質濃度增加，最終形成凝聚物。例如，在32μM tick-GRP77溶液的蒸發實驗中，可觀察到液滴邊界處熒光增強，隨后出現相邊界，形成凝聚物。增加初始蛋白濃度會縮短凝聚開始的時間，如從16μM增加到128μM時，凝聚時間從12.7±0.7min縮短到7.5±0.9min。
圖2：蜱蟲GRP77通過簡單凝聚發生液-液相分離形成液態凝聚物
LLPS主要由精氨酸和芳香族殘基驅動
將tick-GRP77分為N端（20-51）和C端（52-96），二者均無序且甘氨酸含量相近，但N端富含酸性氨基酸（凈電荷-3.4），C端富含堿性氨基酸（凈電荷2.5）。在相同條件下，C端凝聚速度更快（ti = 9min）且傾向于潤濕玻璃表面，N端凝聚速度與tick-GRP77相似（ti = 13min）。這表明C端的陽離子-π和π-π相互作用更強，是LLPS的關鍵促進因素，而N端的靜電排斥使其凝聚起始延遲。
圖3：精氨酸和芳香族殘基是蜱蟲GRP77相分離的關鍵驅動力
蜱蟲GRP77在磷酸鹽存在下形成凝聚物
添加Na2HPO4可使tick-GRP77立即發生凝聚，通過實驗得到相圖，表明凝聚與蛋白濃度和孵育時間有關。例如，1M Na2HPO4存在下，63μM和125μM tick-GRP77溶液可瞬間凝聚，16μM溶液在1.5h孵育后也能形成凝聚物。
圖4：蜱蟲GRP77在磷酸鹽存在下形成凝聚物
蜱蟲GRP77凝聚物經歷液-凝膠轉變
高濃度tick-GRP77（125μM）在Na2HPO4中孵育較長時間（5.5h）后，凝聚物的融合被阻止，形成穩定的簇，表明發生了液-凝膠轉變。熒光恢復實驗（FRAP）對比新鮮（0.5h）和老化（18h）的凝聚物，發現二者均表現出部分熒光恢復，表明GRP分子在凝聚物內運動受限，具有粘彈性行為；老化樣品的熒光恢復率顯著降低（新鮮樣品約49%，老化樣品約2%），表明其從液態轉變為固態。力譜測量表明，空氣干燥的tick-GRP77凝聚物具有高粘附性，其粘附功Wadh = 1.4×102 Jm-2，比非凝聚條件下（1.31×102 Jm-2）高四個數量級，可能在蜱的粘附中起關鍵作用。
圖5：GRP凝聚物形成粘彈性網絡并表現出粘合特性
蜱蟲唾液中的蛋白質凝聚物
通過對自然蜱蟲唾液的分析研究人員觀察到了蛋白質凝聚物的存在。這些凝聚物在顯微鏡下呈現出微米級的球形，并且具有液態特性，如液滴融合。當y俺就人員在唾液提取物中加入高鹽濃度時，這些凝聚物進一步形成了纖維狀結構，這在實驗室中對GRPs的研究結果相吻合。這些發現證實了蜱蟲唾液中的蛋白質凝聚物不僅在實驗室條件下存在，而且在自然環境中也是蜱蟲生物學的一部分。這些凝聚物可能是蜱蟲黏附機制的核心，為未來的蜱蟲控制和生物技術應用提供了新的研究方向。
圖6：蜱蟲唾液腺提取物中存在富含蛋白質的相分離滴
小結
該研究不僅揭示了蜱蟲唾液中GRPs的LLPS和老化行為，還為理解蜱蟲如何在宿主身上附著提供了新的視角。這些發現不僅對蜱傳疾病的預防具有重要意義，也為開發新型生物粘合劑和藥物遞送系統提供了潛在的應用前景。通過干擾蜱蟲GRPs的相分離，我們可能能夠開發出阻止蜱蟲附著的新方法，從而減少蜱傳疾病的風險。
參考文獻：
Ganar, K.A., Nandy, M., Turbina, P. et al. Phase separation and ageing of glycine-rich protein from tick adhesive. Nat. Chem. (2024).
https://doi.org/10.1038/s41557-024-01686-8
