親核芳香取代反應（SNAr）是目前藥物化學和農藥化學領域應用最廣泛的反應類型，通過SNAr反應構筑C-C和C-X化學鍵（X=O, N, S）的方式構建復雜結構有機分子。SNAr反應通常需要較強的反應環境，比如使用極性非質子溶劑，化學計量比的堿性物質，升高的反應溫度，這導致難以控制反應的選擇性。在SNAr反應之外，人們還開發了幾種催化反應，包括有機分子氫鍵或者相轉移催化反應。有鑒于此，曼徹斯特大學Igor Larrosa教授、Anthony P. Green教授等通過設計活化的Arg（精氨酸）殘基的酶進行生物催化反應，實現了立體選擇性SNAr反應。通過多輪定向進化得到的工程化酶催化劑SNAr1.3比未工程化的酶催化劑性能提高了160倍，對缺電子芳烴實現了接近完美（>99 % e.e.）的立體選擇性控制。SNAr1.3的反應速率達到0.15 s-1，TON達到>4000，對廣泛的親電試劑和親核試劑具有兼容，包括挑戰性的1,1-雙芳基立體結構。通過生化、結構、理論計算研究，揭示了SNAr1.3的催化反應機理。反應機理包括Arg124和Asp125關鍵殘基形成了一個鹵結合口袋。這項研究通過酶催化反應實現了具有里程碑意義的合成反應，為SNAr催化反應提供了高效率普適性的方法。圖1. SNAr（親核芳基取代反應）和立體選擇性SNAr enzyme的定向進化為了得到合適的酶起始模板，作者從前期研究發現具有可編程活性位點的Morita-Baylis-Hillman酶（MBH）開始。MBH酶具有Arg124殘基氫鍵供體能夠與相鄰的缺電子芳烴結合。由于人們在以往的研究中發現氫鍵催化劑能夠加快SNAr反應速率，因此首先測試一系列MBH酶的混雜SNAr反應性，發現BH32.8變體（記作SNAr1.0）能夠進行乙基-2-氰基丙酸酯（1）和2,4-二硝基氯苯（2）的SNAr偶聯，BH32.8變體具有適中的轉化率和適中的立體選擇性（ca. 5 % e.e.）（圖1b）。隨后，對BH32.8（SNAr1.0）其進行工程化設計，改善反應活性和立體選擇性（圖1c）。首先對活性位點、以及二級配位球附近的41個殘基基團使用NNK退化密碼子進行隨機突變，隨后通過UPLC監控1和2轉化為3的反應情況。選擇其中最好的變體進行下一輪的突變，將得到的有希望的突變體結合DNA改組（shuffling）方法結合。總共對4000個克隆體的測試，其中六個突變體作為SNAr1.3變體（圖1c和1e）。在His23殘基（MBH酶的關鍵親核位點）的進化過程（排除His23殘基的親核催化SNAr），發現突變體能夠實現93 %的轉化率，而且生成的唯一產物是3，比SNAr1.0僅為3 %的產率明顯更好，而且該突變體同樣得到更好的立體選擇性，立體選擇性達到96 % e.e.（遠高于SNAr1.0的5 % e.e.）。通過X射線衍射表征得到產物3的絕對結構。在制備量級的合成反應中，以51 mg的2能夠達到90 %的轉化率，產物3分離收率達到70 %。重結晶的產物立體選擇性達到98 % e.e.。通過動力學實驗測試催化反應的詳細情況，結果表明反應動力學常數提高160倍，SNAr1.0和SNAr1.3的動力學常數分別為0.0040±0.0002 min-1和0.65±0.01 min-1，隨后在1的飽和濃度下測試反應動力學，結果kcat/kM2增強160倍。此外，當PBS緩沖液變成磷酸鈉，反應速率能夠進一步提高3倍，這是因為較高的Cl離子濃度阻礙酶催化性能。調節鹵離去基團對SNAr1.3催化活性和選擇性的影響。當使用2的溴（4）和碘（5）類似物進行反應，酶催化活性分別提高3.8倍和8.6倍（圖2b）。當使用碘的類似物（5），反應速率達到8.81±0.11 mM-1 min-1，產物3的立體選擇性超過99 % e.e.，而且酶催化反應的TON達到4000（圖2c）。通過制備量的反應（當SNAr1.3的量僅為0.5 mol %，能夠以>99 %的轉化率和91 %的分離收率和99 % e.e.立體選擇性生成150 mg (R)-3），驗證了酶催化反應的應用前景。反應兼容性。通過對各種親電、親核偶聯反應物的兼容性測試，研究了SNAr1.3的兼容性（圖3a）。非常重要的是，SNAr1.3對許多硝基芳烴兼容，包括氰基、三氟甲基、酯、酮、磺基、吡啶環的底物兼容，能夠得到較好或者優異的e.e.立體選擇性（圖3a），而且在這些反應中沒有發現副反應產物生成。此外，反應對親電試劑具有非常好的兼容性，比如酯、酰胺、2-烷基取代基，對含有C-芳基的環狀β-酮酯同樣兼容。這個結果與化學催化反應（使用化學計量比的堿或者小分子有機催化劑）生成O-芳基化和C-芳基化混合物的現象明顯區別。此外，SNAr1.3能夠使用乙基2-硝基丙酸酯合成含有四級N立體中心的光學純化合物。另外SNAr1.3能夠使用苯酚或者活化的有機醇作為親核試劑（pKa<12.4）構筑C-O化學鍵，形成雙芳基醚或者芳基烷基醚。構筑1,1-雙芳基的四級碳結構化合物。該反應能夠構筑生物活性化合物中常見的雙芳基四級碳結構，這種結構的立體選擇性構筑是個非常大的挑戰。作者測試了2和乙基2-氰基-2苯乙酸的反應，使用SNAr1.2實現了適中的轉化率（27 %）和適中的立體選擇性（46 % e.e.）。隨后通過定向進化得到變體SNArPh1.0，催化活性提高3倍，并且立體選擇性達到84 % e.e.。當使用芳基碘化物作為反應物替代芳基氯，轉化率能夠提高至96 %，立體選擇性達到87 % e.e.。實驗結果表明SNArPh1.0能夠作為具有應用價值的催化劑合成各種1,1-雙芳基化產物。作者通過生化實驗、結構表征、理論計算等研究手段研究SNAr1.3的催化反應機理，以及酶進化是如何增強催化反應的活性。首先，驗證了SNAr是否與4-氯苯甲酰-CoA脫鹵酶（4-chlorobenzoyl-CoA dehalogenase）類似，通過形成酶-反應物的共價結構中間體，作者將SNAr1.3和芳基鹵化物5分子在沒有加入親核偶聯試劑的情況下，放在一起培養。隨后檢測鹵的產生以及蛋白的質量變化情況。觀測發現沒有因為芳基鹵化物水解產生的酚類產物。結果表明在催化反應（8.8 min-1）的區間內，沒有產生酶和反應物形成的共價結構中間體，說明SNAr1.3催化反應過程沒有生成芳基-酶的中間體。通過X射線晶體表征（1.8 ?）研究SNAr1.3的反應機理。通過K39A變體在蛋白表面進行結構表征分析，結構表征結果表明SNAr1.3與SNAr1.0沒有明顯區別（RMSD 0.89 ?）。隨后的表征發現兩個內部碘結合位點，結合位點由Met64、Arg65、Arg124、Asp125、Pro128構成（圖4a）。Arg和Asp是天然鹵結合口袋常見的殘基位點。將SNAr1.3和5一起進行結晶，得到的結構發現兩個不同的結構，表明反應物結合具有異質性。5結合的位置主要位于鹵結合空位（圖4b），同時在芳基反應物的下部具有另一個空位，能夠用于容納親核性的偶聯反應物分子。對鹵結合位點進行位點選擇性突變研究。R124A和D125N/A突變能夠將反應速率降低180倍或者68/22倍，M64A和R65A變體導致反應速率降低5.4倍或10倍。這些研究結果進一步的說明，鹵結合口袋對于催化反應的重要作用。總之，這項研究為SNAr催化反應建立了酶催化反應的解決方案，SNAr反應是化學工業領域最重要的轉化反應類型。這項研究關注于開發能夠構筑四級碳立體位點的酶催化劑。這項研究表明，這種SNAr酶能夠用于合成含氮的立體中心位點，構筑C-O化學鍵，進行區域選擇性的SNAr反應，表明著這種工程化的酶催化劑具有廣闊的合成應用前景。這項研究開發的SNAr酶具有令人印象深刻的催化活性、選擇性、反應物兼容性。這項研究僅僅包括4000個變體，深入的研究蛋白的序列能夠的高更多具有前景的SNAr酶催化劑，包括對更加惰性的親電、親核試劑兼容。結構和機理研究為開發SNAr1.3用于高效選擇性催化的活性位點提供幫助。這項研究的分析結果為從頭設計特定功能需求的SNAr酶催化劑的設計提供幫助。通過將現代蛋白設計方法和高通量的實驗室進化技術結合，這項研究有助于推動開發更多更具價值的SNAr變體，促進現有合成方法學的發展。
參考文獻
Lister, T.M., Roberts, G.W., Hossack, E.J.et al. Engineered enzymes for enantioselective nucleophilic aromatic substitutions. Nature (2025).
DOI: 10.1038/s41586-025-08611-0
https://www.nature.com/articles/s41586-025-08611-0
