唐奕教授本科畢業于賓夕法尼亞州立大學，在David A. Tirrell教授完成博士，在Chaitan Khosla教授的指導下完成了博士后的工作，他的研究方向主要集中在天然產物生物合成和生物催化領域。曾獲美國總統獎、美國化學學會Author C. Cope 獎等多項殊榮。C-H鍵是有機分子中最常見的化學鍵，因此C-H鍵在化學合成中處于非常重要的地位。C-H鍵轉化反應關鍵的挑戰是如何選擇性對特定C(sp3)-H化學鍵進行轉化。在這些年，人們發現金屬酶能夠催化C(sp3)-H化學鍵的官能團化。雖然近些年得到顯著的發展和進步，但是對惰性C(sp3)-H鍵的酶催化鹵化反應仍然只能通過非血紅素Fe/α-酮戊二酸依賴性鹵化酶（α-ketoglutarate-dependent halogenase），因此導致化學可及性受到局限。 有鑒于此，加州大學洛杉磯分校唐奕教授、Masao Ohashi教授等報道在含有未知功能結構域3328（DUF3328）的蛋白質家族中，發現了一種未曾發現的鹵化酶ApnU，并進行表征。ApnU在活性中心位點使用Cu作為催化劑，對多個惰性C(sp3)-H鍵進行迭代催化氯化。通過Cu金屬中心具有的較軟特點，ApnU展現了出乎預料的酶催化C(sp3)-H官能團化性能，包括碘化（iodination）和硫氰化（thiocyanation）。通過生化特征和蛋白質組學分析，鑒定了ApnU的低聚功能態（oligomeric state），這種低聚態呈現了共價連接的二聚體，其中含有由雙硫鍵形成的三個基本結構，一對是鏈間雙硫鍵，兩對鏈內雙硫鍵。通過ESR表征，驗證ApnU含有的金屬配位活性位點含有雙核II型Cu中心位點。這項研究發現拓展了鹵酶催化C(sp3)-H鹵化反應的能力，為雙核Cu依賴性氧化酶的提供基礎性的理解。酶的功能未知3328(DUF3328)域在真菌天然產物生物合成途徑中廣泛的存在，根據其基因特點，其包括C(sp3)-H氧化官能團化，包括成環、去飽和、羥基化、氯化。ApnU是這種酶家族的一種，比如atpenin B (1), atpenin A4 (2), atpenin A5 (3)（圖1c）。首先，通過基因失活（ genetic inactivation）驗證了ApnU在氯化反應中由1轉化為2和3的情況，發現敲除apnU之后，2和3消除，但是1逐漸累積；隨后，補充apnU之后，恢復了生成2和3的活性。 通過分析序列和結構，發現ApnU含有兩個HXXHC結構，四個His側鏈能夠形成平面的四個角（約5.4?×6.1?），兩個半胱氨酸殘基位于平面下方（圖1d）。ApnU的結構預測結果表明其含有49個殘基（編號31-79）的N-終端跨膜螺旋結構（N-terminal transmembrane helix）（圖1d）。將75 N終端殘基替換為可溶的標簽（10個氨基酸序列：MAKKTSSKGK），得到部分可溶的蛋白并進行提純。將純化的蛋白與1、康壞血酸、NaCl一起進行培養，發現1轉化為單氯化2主要產物的轉化率較低（10 %），生成二氯化產物3次要產物。向反應中加入EDTA后反應活性消失，表明酶催化活性具有金屬依賴性。在優化的條件下，能夠從包涵體中重新折疊蛋白質，獲得可溶的ApuU。將重新折疊的apo-ApnU與1、抗壞血酸、各種過渡金屬（Mn(II), Fe(II), Co(II), Ni(II), Cu(II), Zn(II)）進行培養，LC-MS表征結果表明，只有在Cu(II)存在時，1具有氯化反應活性，50 %的1轉化為氯化產物3和4。其中，4的質譜為m/z=400，對應于三氯化產物。此外發現少量5產物（m/z=296），對應于1的脫氫產物。放大量反應并且分離4和5，進行NMR表征。NMR表征結果表明4號分子的第三個氯位于3的C5′位點，得到偕二氯的四級碳原子。總之，以上研究結果表明ApnU是首個被發現能夠迭代C(sp3)-H氯化的Cu依賴性鹵化酶。 與大多數Cu金屬酶相似，ApnU通過O2作為氧化劑活化C-H鍵，在無氧條件下ApnU沒有表現催化活性（圖2c）。抗壞血酸作為必不可少的還原劑，其他的還原劑（比如DTT(二硫蘇糖醇)和Na2S2O4）無法用于氯化反應（圖2d）。在pH 6.0 MES緩沖液中，ApnU獲得最好的氯化反應活性。當NaCl濃度增加，氯化程度（3 vs 4）增加，在濃度為50 mM NaCl時得到最大的氯化反應數目。在沒有氯化物的情況，整體催化活性明顯降低，表明氯化物與Cu中心之間的配位對于C(sp3)-H鍵活化非常重要。由于ApnU使用的是軟金屬Cu用于鹵化反應，因此作者認為ApnU能夠與Fe依賴性NHFeHal起到不同的鹵化物/準鹵化物進行反應。因此，將不含氯的ApnU與1以及不同的陰離子進行活性測試，結果表明能夠與Br-、N3-、NO2-生成官能團化的加合物（與Fe依賴性NHFeHal類似）。此外，柔性更高的陰離子（I-、SCN-、SeCN-）同樣能夠反應（Fe依賴性NHFeHAl不具有這種催化活性）。在這些陰離子濃度更高的情況下，反應只能生成單取代的產物，而且沒有副產物生成。放大量實驗能夠合成并分離碘化物、硫氰酸鹽產物、硒氰酸鹽產物（6-8）。通過NMR分析發現反應的區域選擇性是C5′（圖2e）。當使用F-、CN-、OCN-、HCOO-、NO3-、CH3S-，未見產物生成（圖2e）。ApnU的獨特Cu活性位點使得ApnU實現了區域選擇性的C(sp3)-H官能團化轉化。這種非Fe依賴性鹵化酶拓展了酶催化C(sp3)-H鍵官能團化的種類。在重新折疊形成ApnU的過程中，需要加入GSH/GSSG，當GSH和GSSG的量相同，折疊的效果最好。當不加入GSH/GSSG，雖然能夠獲得可溶的蛋白，但是得到的蛋白完全沒有催化活性。這個結果表明ApnU的六個半胱氨酸進行正確重構是蛋白質折疊的關鍵。 使用陰離子交換色譜、尺寸排阻色譜表征，發現重新折疊的ApnU具有兩個主要物種（I和II），質量為30 kDa（圖3a）。分別分離并提純，發現只有I具有氯化酶的催化活性，II沒有氯化酶的催化活性。通過LC-QTOF-MS表征變性蛋白的質譜，發現分子量為59,056 Da，對應于ApnU的二聚體，并且對應于由于生成二硫化學鍵導致減少12-Da（圖3b）。通過天然蛋白質的質量分析，進一步證實了ApnU的二聚體狀態。對HXXHC的四個his進行突變，驗證四個his對于ApnU的活性都是必須的，這可能是因為其Cu結合的作用。通過ICP-MS表征His6-tag-free ApnU，發現每個ApnU的金屬最大結合數目為2.3±0.1。通過EPR表征His6-tag-free ApnU的Cu中心位點結構和性質。當加入過量的Cu(II)，并且通過脫鹽或者透析處理干凈樣品，含有Cu(II)的ApnU的EPR譜結果表明type II型Cu(II)信號，每個活性位點具有接近2個Cu原子自旋（圖4a）。加入過量抗壞血酸或者在無氧條件測試，發現Cu(II) EPR信號消失，驗證了抗壞血酸將Cu(II)還原為Cu(I)啟動催化反應。 模擬EPR譜的結果表明兩個有所區別的Cu(II)信號g值和超精細耦合常數Az(Cu)（圖4a），表明每個Cu(II)處于N/O混合配位環境和平面四方形結構。觀測的g≈2.05的信號超精細裂分結果分析發現應該是14N與Cu(II)之間的超精細相互作用，這個結果支持了Cu結合位點。光譜表征結果表明，靜息態的兩個Cu沒有磁耦合，表明兩個Cu(II)原子的間距超過6 ?。根據實驗結果，以及已知的雙核Cu酶催化機理，DFT理論計算，提出了ApnU的可能鹵化反應機理（圖4b）。靜息態含有兩個沒有耦合的Cu(II)中心，隨后通過抗壞血酸還原為Cu(I)，隨后O2活化生成過氧橋連雙核INT1(μ-η2:η2-peroxo)Cu(II)Cu(II)。Cu中心與陰離子配位，形成INT2，通過抗壞血酸發生摘氫原子反應生成INT3(μ‐O·)(μ‐OH)Cu(II)Cu(II)。INT3是反應活性物種，能夠從反應物1摘氫，計算結果表明該步驟的能壘為4.4 kcal mol-1，通過該步驟生成鹵化產物，同時消耗一個Cu(II)位點。隨后另一個Cu(II)與抗壞血酸反應重新開始催化反應。這項研究發現了從前未知的ApnU（從屬于真菌蛋白的DUF3328家族），并且進行生化分析表征。ApnU是Cu依賴性催化劑，能夠對多個C(sp3)-H鍵進行迭代的氯化，ApnU含有保守的雙HXXHC結構（其他DUF3328蛋白同樣存在），通過EPR和ICP-MS表征驗證與兩個Cu(II)金屬離子結合。ApnU的Cu中心具有超預料的C(sp3)-H官能團化性能，這些催化活性與Fe的鹵化酶不具備的。雖然人們發現黃素依賴性鹵化酶能夠進行區域選擇性C(sp3)-H碘化，但是ApnU能夠進行位點選擇性的C(sp3)-H碘化反應、硫氰酸化反應、硒氰酸化反應。Fe依賴性酶雖然具有優秀的催化活性，而且容易進行進化，但是Cu依賴性酶仍然展現了對酶催化C(sp3)-H鍵官能團化反應種類的拓展。這項工作為研究目前未曾關注的DUF3328金屬酶家族提供廣闊的機會，有助于開發新型酶功能。 Chiang, CY., Ohashi, M., Le, J. et al. Copper-dependent halogenase catalyses unactivated C?H bond functionalization. Nature (2025).DOI: 10.1038/s41586-024-08362-4https://www.nature.com/articles/s41586-024-08362-4
