以乳腺癌基因診斷為代表，單點突變的識別診斷意義重大！
在醫(yī)學(xué)檢測中，乳腺癌的基因診斷變得愈發(fā)重要。中國乳腺癌發(fā)病率的增速是全球平均增速的兩倍，發(fā)病率列世界第一；乳腺癌發(fā)病和死亡分別位居我國女性惡性腫瘤發(fā)病和死亡的第1位和第5位。在世界范圍內(nèi)，女性乳腺癌的發(fā)病率僅次于肺癌，而帶有突變基因的人群要比普通人群的患病風(fēng)險高出59-87%。
導(dǎo)致乳腺癌的BRCA1基因突變因種族和地域而異，有幾百上千種。以往的診斷方法是提取整個基因組并對BRCA1進(jìn)行全段測序，再與正常基因?qū)Ρ龋治鐾蛔兾稽c。在這些基因突變中，有些并不會導(dǎo)致癌變，世界范圍內(nèi)，最為普遍、風(fēng)險最高的BRCA1突變有8種。
精確設(shè)計指導(dǎo)合成納米檢測試劑頗有難度
金納米材料具有獨特的穩(wěn)定性和生物相容性，因此常作為基底材料被用于生物醫(yī)學(xué)傳感和成像。雖然金納米顆粒有很多結(jié)構(gòu)，但這些結(jié)構(gòu)都是采用試錯法不斷積累經(jīng)驗而獲得，目前無法合成預(yù)先設(shè)計的指定結(jié)構(gòu)。
結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，醫(yī)學(xué)傳感對靈敏性的特殊要求促使研究人員不斷更新納米技術(shù)，優(yōu)化納米結(jié)構(gòu)，力求實現(xiàn)對少量生物分子、甚至于單分子的識別和檢測。尤其重要的是，基因中單個堿基的突變（單點突變）很難被發(fā)現(xiàn)，目前常用的基于PCR的測序方法無法滿足生物傳感技術(shù)對實時高效的要求，對特定疾病的診斷也缺乏針對性。
馬興毅團(tuán)隊通過生命物質(zhì)來解決無機(jī)納米的問題
在生命體中，DNA指導(dǎo)合成蛋白質(zhì)。2016年，韓國高麗大學(xué)融合化工系統(tǒng)研究所研究教授馬興毅首次提出，可將DNA分子作為骨架，指導(dǎo)金納米顆粒的合成。2019年，馬興毅及其團(tuán)隊聯(lián)合首爾國立大學(xué)和美國科羅拉多大學(xué)利用DNA分子調(diào)控合成出結(jié)構(gòu)預(yù)先設(shè)計的高靈敏金納米顆粒，實現(xiàn)了對乳腺癌相關(guān)基因中單點突變的識別診斷。
第一作者：馬興毅
通訊作者：Sang Jun Sim
通訊單位：高麗大學(xué)（韓國）
研究亮點：
1. 發(fā)明了利用DNA分子設(shè)計性合成(Synthesis-with-design)金納米顆粒的方法。
2. 合成出帶有2納米橋結(jié)構(gòu)的新型金顆粒，具有極高傳感靈敏度，最少可識別4個蛋白質(zhì)分子與被測基因的結(jié)合。利用單個顆粒，實時、無標(biāo)記地對基因中1個位點的突變進(jìn)行檢測。
3. 首次以線圖集的形式描繪人類基因錯配修復(fù)蛋白MutS對單堿基突變的識別能力及其差異(GT>GG>+C>AA>TC>?C>AC>GA)，推出新的基因診斷方法（無需測序）。
4. 設(shè)計制造出8個基因芯片，可分析診斷與乳腺癌關(guān)系最為密切的8類基因單點突變。
要點1. 設(shè)計性合成技術(shù)：如何獲得極靈敏的金納米顆粒？
研究團(tuán)隊將單個DNA分子作為骨架，介導(dǎo)金納米顆粒的合成，相關(guān)成果在2016年發(fā)表于Nature Communications（見下圖和參考文獻(xiàn)2）。團(tuán)隊設(shè)計DNA分子的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而實現(xiàn)對金納米結(jié)構(gòu)的調(diào)控，控制精度在5納米以下，整個合成過程在水溶液中進(jìn)行，所合成的顆粒可直接用于生物醫(yī)學(xué)工程。
圖1. 金納米顆粒的設(shè)計性合成。
要點2. 單顆粒傳感技術(shù)：如何達(dá)到少數(shù)幾個生物分子的檢測限？
傳統(tǒng)的傳感技術(shù)所使用的宏觀或微觀尺度的基底材料無法對低濃度的被檢測物質(zhì)做出反應(yīng)，而且，檢測操作需要進(jìn)行材料修飾、阻止非特異性結(jié)合、去除雜質(zhì)、收集信號等，步驟越多，越容易導(dǎo)致可信度降低、不穩(wěn)定性增大、檢測限提高。目前，極少的傳感技術(shù)可以實現(xiàn)對少數(shù)幾個生物分子的實時檢測。
為此，團(tuán)隊將金納米顆粒作為傳感材料，并將整個傳感尺度縮小到一個顆粒上。對于該30納米左右的傳感顆粒，生物分子在尺度上不再微不足道，每個分子在顆粒上的結(jié)合都會顯著的影響傳感信號；甚至，分子間的結(jié)合力、分子間距等極微觀的信息也可實時讀取（下圖）。
圖2. 單顆粒傳感系統(tǒng)。
重要的是，整個傳感操作不須使用任何原有生理反應(yīng)以外的輔助分子，不聚集熱量而破壞生物分子，亦不引入電場或磁場影響原有生物反應(yīng)。在傳感可靠性和靈敏性方面可以與單顆粒納米傳感技術(shù)相媲美的是原子力顯微技術(shù)，然而，原子力顯微技術(shù)需要自定義分析區(qū)域，所得到的數(shù)據(jù)無法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，從而無法用于臨床實踐。
要點3. 實際意義：基因突變的診斷無需測序，乳腺癌的基因檢測獲革新
團(tuán)隊使用所合成的金橋納米顆粒作為基底材料，針對這8種突變，分別設(shè)計構(gòu)建了8款單顆粒傳感芯片。將被檢測樣品注入芯片，傳感平臺可實時讀取分析結(jié)果，無需測序即可判斷出突變類型。
本研究已對不同的突變位點的識別結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，繪制出不同的單點突變的檢測數(shù)據(jù)圖集，據(jù)此分析診斷了乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞株內(nèi)的相關(guān)基因突變并獲得臨床驗證。具有重要應(yīng)用意義的是，整個傳感操作只需要30微升樣品，不需特殊的輔助物質(zhì)、標(biāo)記分子或復(fù)雜的溶液，檢測時間僅需15分鐘，可讀出5個被測基因與4個錯配識別分子相互結(jié)合后的差異性信號。
圖3. 乳腺癌的基因診斷：5382insC芯片對樣品做出信號響應(yīng)，表示樣品的基因中多出一個胞嘧啶。
小結(jié)
工程師首先是設(shè)計師，將設(shè)計變?yōu)楝F(xiàn)實，是工程師傾心而為的關(guān)鍵。設(shè)計幾個納米的、用于傳感的、極其靈敏的結(jié)構(gòu)，并將其變?yōu)閱晤w粒的金，實現(xiàn)對單點基因突變的高效檢測，是馬興毅及其所在團(tuán)隊在這項工作中實現(xiàn)的突破。
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參考文獻(xiàn)：
[1] Ma X, et. al. Single gold-bridged nanoprobes for identification of single point DNA mutations. Nature Communications, 2019.
DOI:10.1038/s41467-019-08769-y
https://www.nature.com/articles/s41467-019-08769-y
[2] Ma X, et. al. Gold nanocrystals with DNA-directed morphologies. Nature Communications, 2016.
DOI:10.1038/ncomms12873
https://www.nature.com/articles/ncomms12873
作者簡介：
馬興毅 高麗大學(xué)融合化工系統(tǒng)研究所擔(dān)任全職研究教授。本科畢業(yè)于哈爾濱工業(yè)大學(xué)，分別于成均館大學(xué)（SKKU）和高麗大學(xué)（Korea University）獲得工學(xué)碩士和博士學(xué)位。
研究所以技術(shù)產(chǎn)業(yè)化和科研立項為工作重點，馬興毅所在團(tuán)隊主要負(fù)責(zé)納米生物技術(shù)的研發(fā)，具體研究方向包括：（1）利用生物分子，制備新型光學(xué)納米材料，用于醫(yī)學(xué)傳感和成像；（2）利用微流體芯片篩選靶細(xì)胞，將細(xì)胞用于高效生物發(fā)酵，制備抗腫瘤活性物質(zhì)。主要成果獲得韓國科技部表彰。
高麗大學(xué)融合化工系統(tǒng)研究所隸屬于化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，化工專業(yè)在2019QS世界大學(xué)排名第43位。如有討論和合作，請致信maxy@korea.ac.kr。
