第一作者：陳文
通訊作者：郭俊凌、James Chou
通訊單位：四川大學、哈佛大學
研究亮點：
發展了一種膜蛋白呈遞技術——以植物多酚修飾的納米顆粒為內核，通過納米顆粒和膜蛋白的特異結合作用，將膜蛋白脂質體高效地包裹在納米顆粒表面形成類病毒結構。
膜蛋白呈遞研究難點
目前在研發的抗體藥物，大部分都是以生物膜蛋白以及膜錨定蛋白為靶點。但是，把這些生物膜蛋白質呈遞給免疫系統是當前的核心難點，特別是大部分關鍵的膜蛋白需要在有膜或者類膜的環境下才能保持正常的構象及生物學功能。
現在主要有以下三種方法來呈遞膜蛋白：1. 將膜蛋白放入脂質體中；但是脂質體本身并不穩定，并且容易和細胞內的囊泡相融合；同時，在把膜蛋白質重組到脂質體的過程中，膜蛋白的朝向完全是隨機的；2. 納米碟也被廣泛的用作膜蛋白的載體，并且非常穩定；但是納米碟尺寸較?。?5納米以內），一個納米碟只攜帶1-2個膜蛋白，對于免疫系統的刺激作用很弱；3. 利用類病毒顆粒來呈遞；類病毒顆粒的制作程序對于每個膜蛋白都不一樣，每個系統都要花費很多的時間和材料來優化，而且很多過程難以人為控制。
成果介紹
為了解決膜蛋白的呈遞問題，四川大學郭俊凌與哈佛醫學院James Chou、陳文聯合團隊以植物多酚修飾的納米顆粒為內核，通過納米顆粒和膜蛋白的特異結核作用，將膜蛋白脂質體包裹在納米顆粒表面。此方法被命名為SPLANDID （Supported ProteoLiposomefor ANtigen DIrected Display）。通過此方法，他們成功的將艾滋病病毒的跨膜蛋白和膜外臨近區（HIV-1 MPER-TMD）重組在加固的脂質體表面并進行了免疫實驗。
圖1. 納米顆粒支撐的蛋白質脂質體用于膜蛋白單向陳列。
SPLANDID方法的具體流程如圖一所示：1a. 空心和實心的納米顆粒都可以用來作為內核（包括植物多酚修飾的顆粒，以及DNA折紙法制備的DNA空心球）；1b. 純化后的膜蛋白質被重組在脂碟（bicelle）中（脂碟包含脂成分和表面活性劑來模擬膜環境）；1c. 將納米顆粒的表面修飾上某些化學基團，使之可以和膜蛋白質上的親和標簽特異性的結合（包括Ni-NTA分子和組氨酸標簽的結合）; 1d. 膜蛋白質攜帶脂碟被有序的吸引到納米顆粒的表面，通過透析作用或者其他方法逐漸的將表面活性劑去掉，脂分子會相互融合，進而形成封閉的包含有膜蛋白質的脂質體。因為膜蛋白是通過親和標簽吸附到納米顆粒的表面，所以帶有親和標簽的一端會朝向納米顆粒，并最終被包裹在脂質體內部；而另外一端會暴露在脂質體的表面。這樣組裝的脂質體就攜帶有序單一朝向的，并且高拷貝數，具有活性的膜蛋白質。
該研究首先制備了植物多酚修飾的金納米顆粒，并將NTA分子與多酚苯環上產生親核反應，并加入鎳離子，從而在金納米顆粒表面形成Ni-NTA配合物（圖二a）。修飾后的納米顆粒和組氨酸標簽的親和作用通過核磁共振譜進一步驗證（圖二b）。將重組在脂碟中的HIV-1 MPER-TMD和修飾后的金多酚納米顆粒以最佳比例混合，并通過透析去掉系統中的表面活性劑，最終得到了由膜蛋白和納米顆粒誘導形成的大小均一的膜蛋白脂質體（圖二d，e）。在HIV-1 MPER-TMD的N端和C端分別有抗Flag標簽和組氨酸標簽，最終制備的HIV-1 MPER-TMD脂質體只能被抗組氨酸標簽的抗體識別，而不能被抗Flag的抗體識別（圖二g），說明了HIV-1 MPER-TMD在脂質體的朝向是單一的，能被精確控制的。同時，該研究也測試了利用DNA折紙法形成的空心球作為內核也同樣能指引HIV-1 MPER-TMD脂質體的組裝（圖二f）。
圖2. 采用重組MPER-TMD制備納米顆粒支撐的膜蛋白脂質體。
通過SPLANDID方法制備的MPER-TMD脂質體能夠高效的刺激免疫系統產生特異性抗體。將組裝好的MPER-TMD脂質體注射到豚鼠的體內，并在每次注射后的4個星期收集豚鼠的血清（免疫實驗仍在進行中）。通過ELISA反應的檢測，血清里含有大量可以和MPER-TMD蛋白特異性結合的抗體，并且抗體的含量隨著免疫實驗的進行而增加（圖三）。MPER-TMD蛋白由于大部分區域都在生物膜內，具有非常弱的免疫原性，到目前為止還沒有通過免疫MPER-TMD蛋白而誘導產生中和性抗體的記錄。但是，通過SPLANDID方法制備的MPER-TMD脂質體，可以在很短的時間內就能通過免疫反應在動物體內產生的大量的抗體，為鑒定艾滋病的中和性抗體打下了良好的基礎。
圖3. Ni-NTA-AuNP支撐的MPER-TMD膜蛋白脂質體的免疫原性。
小結
由于該技術的重要應用前景，該研究團隊已提交美國及中國專利。由SPLANDID方法制備的生物膜蛋白脂質體，具有以下的優點：1. 高效組裝成均一的脂質體；2. 蛋白質的單一朝向；3. 每個脂質體能攜帶眾多數量膜蛋白質；4. 完全的模擬生物膜環境，能還原膜蛋白質的功能；5. 由于納米顆粒作為內核，脂質體非常穩定；6. 脂質體的大小可以精確控制。所以的這些優點保證了SPLANDID方法可以用來制備以膜蛋白為基礎的新型疫苗，同時也可以用來研發各種受體蛋白、離子通道以及轉運蛋白的高效抗體。
參考文獻：
Chen W, Cai Y, Fu Q, Chen B, Guo J* and ChouJ J.* Unidirectional Presentation of Membrane Proteins in Nanoparticle‐Supported Liposomes. Angewandte Chemie International Edition,2019.
DOI: 10.1002/anie.201903093
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.201903093
作者簡介：
1. 郭俊凌
墨爾本大學化學與分子生物學博士，中央組織部“國家特聘計劃”青年項目獲得者，四川大學“雙百人才”海外高層次引進特聘教授，博士生導師（2019年入職），曾任職于美國哈佛大學Wyss仿生工程研究中心特聘研究員（研究主頁：https://scholar.harvard.edu/junlingguo）。于墨爾本大學國際著名材料化學家Frank Caruso教授（英國皇家科學院院士，澳大利亞科學院、工程院雙院院士）課題組獲博士學位。哈佛大學期間于Samir Mitragotri教授（美國工程院、美國醫學院雙院院士）課題組、Neel Joshi教授（Wyss仿生工程研究中心委員會委員）課題組、Daniel Nocera教授（美國科學院、美國藝術與科學院雙院院士）課題組開展合作研究。曾師從中國工程院石碧院士、國務院學位委員學科評議組廖學品教授。2019年依托于四川大學制革清潔技術國家工程實驗室，國家“雙一流”重點建設學科，建立生物質先進材料與納米界面研究中心（BMNI），與石碧院士課題組開展學生聯合培養及交叉學科研究。
課題組研究方向將主要涉及“金屬多酚網絡”MPN先進材料的研究與工程應用、生物質仿生材料設計及研究、生物質界面前沿科學的研究和應用開發，致力于先進環境工程、新能源開發、細胞生物工程等前沿領域的基礎及工程研究。近年來，相關研究以第一或通訊作者在《Science》《Nature Nanotechnology》《Energy & Environmental Sciences》《Angewandte Chemie》等國際頂級期刊上發表，共發表高質量學術論文約50篇，頂級期刊封面8篇，并被多家國際著名新聞媒體報道，包括F1000評為領域重大研究、EurekAlert!、Harvard Gazette、ChemViews Magazine、Phy.org、德國之音等，并被《Nature Nanotechnology》、《Nature Biotechnology》、《Nano Today》等學科頂級雜志選為特別專題與研究熱點。
團隊招聘：
生物質先進材料與納米界面研究中心（BMNI）現招聘范圍涉及多個聯合跨學科研究項目，計劃招納各領域賢才多名（不限背景），包括專職博士后（四川大學專業技術職務晉升通道）、博士、碩士研究生（國際頂尖機構聯合培養計劃）、課題組行政助理等；特別優秀的海外博士學位獲得者，可協助申請四川大學特聘副研究員崗位，歡迎前來咨詢交流。相關政策詳情參見四川大學人事處網站：http://rsc.scu.edu.cn/info/1023/1015.htm。有意應聘者請將個人簡歷和工作總結發至junling.guo@scu.edu.cn。
2. 陳文
美國倫斯勒理工學院博士，曾擔任漢密爾頓學院特聘科學家，現任哈佛醫學院博士后，多年來一直從事與蛋白質、核酸等生物大分子以及納米顆粒等領域相關的研究工作，所作研究工作涉及有生物酶工程篩選進化、多功能納米顆粒的制備、生物膜蛋白等大分子高分辨率結構的解析與模擬、生物大分子以及小分子的鑒定、營養食品對慢性病的緩解、同時包括核磁共振及質譜等其他生物物理、生物化學方法的新應用。近年來，在《Nature》、《Cell》、《AngewandteChemie》、《Nature Protocols》、《Nature Communications》、《JACS》等學科頂級期刊發表論文20余篇，并多次獲得美國墾務局、美國農業部以及中華海外磁共振協會創新大獎。
3. James Chou周界文
哈佛大學醫學院終身教授，主要研究方向為蛋白質的結構與功能，利用核磁共振和其他生物物理方法分析膜蛋白結構與動態特性，理解功能與機制。在Nature, Cell, Science, NSMB, PNAS, JACS等國際頂尖期刊共發表SCI論文90多篇，總引用次數超7500次。
在離子通道方面，測定的流感病毒AM2和BM2質子通道的結構，是世界上最早的病毒質子通道的高分辨率結構（Nature，2008; Nature Struct & Mol Biology，2009），并通過對質子通道結構的深刻理解，用實驗證明了AM2與金剛烷胺藥物結合的原理，解釋了甲型流感病毒對金剛烷胺的耐藥機制（PNAS 2009；JACS 2011；Structure2011）；后來又解析了丙肝病毒的p7陽離子通道的結構和其與藥物的結合機制 (Nature 2013)，線粒體鈣離子通道MCU和其與抑制劑Ru360的結合機制 (Nature 2016; PNAS 2017)。
在免疫研究方面，闡明了免疫受體復合體在細胞膜里的裝配原理和信號傳遞機制（Cell 2006, 2008；Nat Immunol 2010；Mol Cell 2016），對免疫學中跨膜信號傳遞的分子機制的理解起到了巨大的作用；研發了一種新的基于殘余偶極耦合(RDC)實驗的分子片段重排(MFR)方法，測定了線粒體非偶聯膜蛋白質(UCP2)的結構（Nature 2011）；使用核磁動力學方法觀察到膜轉運蛋白在非晶體狀況下的動態特性及構相變化 (NSMB 2015)。使用新的bicelle技術解析HIV病毒膜融合蛋白跨膜部分的結構 (Science 2016)。近期發現了TNFR家族蛋白的受體激活新機制（Cell, 2019）。
