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  第一作者：凌云云

通訊作者：夏云生，肖樂輝

通訊單位：安徽師范大學、南開大學

研究亮點：

1. 制備了一種各向異性、二維飛碟狀的AuNP@MnO₂超級納米粒子（由Au納米球和二維MnO₂納米片組成），用于研究與細胞的相互作用。

2. 結果發現，在胞吞過程中，MnO₂納米片彎曲、折疊進一步包裹AuNPs，導致LSPR紅移，可反映二維納米材料與細胞膜動態的相互作用。

3. 紅移之后的藍移因依賴于細胞內的還原性物質，所以也可用來研究細胞內局部環境的氧化還原狀態。

二維納米材料與生物醫學

近年來，二維納米材料因其高比表面積和優異的物理化學性質吸引了越來越多關注，在生物傳感、生物成像、組織工程及載藥等領域均取得了廣泛應用。為了更好地在生物醫藥領域應用二維納米材料，理解它們與生物組織界面如細胞之間動態的相互作用顯得尤其重要。然而，單一的二維納米材料與生物組織界面相互作用時，缺乏有效的信號輸出，極大地限制了相關方面的研究。此外，細胞內的氧化還原狀態是評估細胞功能的一個重要參數，而生物系統的復雜性和儀器的局限性使得在單細胞水平上了解細胞內局部氧化還原狀態存在挑戰。

成果簡介

有鑒于此，安徽師大夏云生課題組與南開大學肖樂輝課題組、香港中文大學Jianfang Wang（王建方）課題組合作制備了一種各向異性、二維飛碟狀（UFO）AuNP@MnO₂ 核@殼結構超級納米粒子（簡稱為AMNS-SPs，由金納米球和二維二氧化錳納米片組成），并在單顆粒水平研究了其與細胞的相互作用。

圖文摘要

由于該超級納米粒子的MnO₂納米片柔軟易變形，在囊泡化過程中，MnO₂納米片彎曲、折疊，進一步包裹金核，使其周圍折射率增大而發生局域表面等離子共振（LSPR）紅移。基于這一設計，實現了納米材料囊泡化過程的動態、實時監測。實驗中，觀察到兩種不同的囊泡化過程，速率相差約一個數量級。而且，該超級納米粒子進入細胞后，與胞內的還原性分子（如谷胱甘肽）發生反應（MnO₂納米片被刻蝕），LSPR藍移。這一現象為在單細胞水平上探索胞內局部環境的氧化還原狀態提供了可能。

要點1：UFO形狀AMNS-SPs的表征

圖1C是AMNS-SPs的高分辨電鏡圖，測得MnO₂納米片的晶格間距分別為0.24和0.29 nm，與文獻報道δ-相MnO₂的{-111}和{020}面相對應，可得出MnO₂納米片是多晶結構。圖1D和1E是AMNS-SPs的原子力顯微鏡（AFM）圖，測得MnO₂納米片的厚度約為4.2 nm。由于單層MnO₂的厚度是0.69-0.72 nm，相應的MnO₂納米片大約是6層。可見，本文中的金球是被直徑較大的各向異性二維MnO₂納米片所包裹，形成了單分散性好且結構清晰的飛碟狀的AMNS-SPs超級納米粒子。

圖1 UFO形狀的AMNS-SPs材料表征。（A）SEM表征；（B）TEM表征；（C）HRTEM表征；（D）AFM表征；（E）高度剖面圖。圖（F）-（I）分別為不同直徑（0，108，151，230 nm）MnO₂納米片修飾的AMNS-SPs TEM表征。（J）不同直徑MnO₂納米片修飾的AMNS-SPs的消光光譜。

通過改變AMNS-SPs合成過程中所用KMnO₄的量來調控MnO₂納米片的直徑（108-230 nm）。隨著KMnO₄量的增多，MnO₂納米片的直徑逐漸增大，同時~380 nm處MnO₂特征吸收峰的強度逐漸增大且AuNPs的LSPR逐漸紅移。對于研究AMNS-SPs與細胞相互作用，厚度超薄又直徑較大的MnO₂納米片是獲得LSPR信號變化的關鍵。所以后續研究選擇直徑為230 nm的MnO₂納米片修飾的AMNS-SPs，而且細胞實驗中AMNS-SPs均被相應的細胞膜包裹。

要點2：AMNS-SPs與細胞的相互作用

隨后，AMNS-SPs用于研究與細胞（HepG2和3T3）的相互作用。如圖2A所示，經孵育后，HepG2細胞膜上出現了橙色的散射點（源于AMNS-SPs）。選擇其中一個顆粒測定其光譜如圖2D所示，0-25分鐘，該顆粒LSPR光譜（λ_max）出現一定程度的波動（597.3±5.8 nm），第26分鐘突然從595.9 nm紅移至618.4nm，隨后逐漸藍移，第40分鐘藍移至575.3 nm。可見，λ_max大致可分為波動（0-25分鐘）、紅移（26分鐘）和藍移（26-40分鐘）三個階段。

圖2 UFO形狀的AMNS-SPs與不同活細胞的相互作用。

在第一個階段，AMNS-SP附著在細胞表面，其位置和方向隨時可能改變，使得AuNP周圍的折射率發生變化導致LSPR光譜出現波動。在第二個階段（第26分鐘），AMNS-SP可能“找到”合適的位點并通過內吞作用進入細胞。由于MnO₂納米片厚度超薄、直徑較大且柔軟易變形，因此在胞吞過程中，MnO₂納米片彎曲、折疊，進一步包裹AuNP，使其周圍折射率增大導致LSPR紅移。隨后，本研究用不同的細胞得到了類似的結果，但LSPR紅移的速率不同，即觀察到兩種不同的囊泡化過程，速率相差約一個數量級（圖2F-J，2K-O）。

我們進一步用時域有限差分（FDTD）法來研究LSPR的紅移。如圖3A和3B所示，以AMMS-SPs中的AuNP進一步分別被1、2和3層MnO₂納米片包裹為模型，模擬計算其LSPR分別紅移25、40和55 nm，所以用FDTD計算驗證了LSPR紅移的實驗結果。不過模擬計算過程中，AuNP是被完全包裹的，而實驗中，變形的MnO₂納米片很難甚至不可能完全包裹AuNP（圖2P和2Q）。因此，LSPR紅移的實驗值應該比計算值略小。

為了進一步說明MnO₂納米片的柔軟易變形是細胞囊泡化過程中LSPR紅移的關鍵，本文制備了另一種厚的MnO₂納米片修飾AuNPs的超級納米粒子（簡稱為TAMNS-SPs），并在相同條件下研究它們與細胞動態的相互作用。如圖3C所示，TAMNS-SPs也是單分散的，并且具有清晰的核殼結構。與圖1B相比，TEM圖像襯度增加表明MnO₂納米片的厚度增加。經AFM（圖3E和3F）測定其厚度約為12 nm。厚度增加導致空間位阻增強，使得MnO₂納米片不能彎曲、折疊進一步包裹AuNP，導致胞吞過程中，TMNS-SP的LSPR沒有發生紅移（圖3J）。

圖3 AMNS-SPs與細胞相互作用的FDTD計算（A、B）及對比實驗（C-J）。

當AMNS-SPs進入細胞后，LSPR光譜立即發生持續的藍移，第40分鐘藍移至575.3 nm。為了研究胞內AMNS-SPs囊泡的狀態，用預標記了DiO的細胞膜來包裹AMNS-SPs，然后觀察它們與HepG2細胞的相互作用。

如圖4所示，熒光共聚焦與暗場顯微鏡圖像均顯示AMNS-SPs進入了細胞且分布在細胞質中。通過三維共聚焦圖像，可以清楚看到DiO分布在細胞質中而不是細胞膜上，說明AMNS-SPs是通過內吞作用而不是細胞膜的融合進入細胞的。如圖4E-4H所示，胞內AMNS-SPs囊泡的散射和熒光信號呈現出高度的共定位，說明經胞吞形成的囊泡得到了很好的保留，變形的MnO₂納米片在胞內仍然包裹著AuNP。因此，從第26分鐘到第40分鐘LSPR的藍移歸因于MnO₂納米片與還原性分子（如谷胱甘肽）反應，即MnO₂納米片被刻蝕。由于胞外的還原性分子可忽略不計，可得出LSPR的藍移發生在胞內。同時LSPR的藍移緊緊跟隨著LSPR的紅移，進一步證實了LSPR的紅移源于AMNS-SP的胞吞過程。

圖4 AMNS-SPs囊泡的胞內狀態。細胞膜用DiO（綠色）標記，細胞核用Hoechst（藍色）標記。

小結

總的來說，MnO₂納米片由于具有超薄的厚度（4.2 nm）與較大的直徑(230 nm)，且柔軟易變形，在胞吞過程中，它們彎曲、折疊進一步包裹AuNPs，使其周圍的折射率增大導致LSPR紅移。由此所構建的LSPR光譜變化是一種便捷且準確的方法用于實時監測二維納米材料與細胞膜動態的相互作用。而在紅移之后的藍移因依賴于細胞內的還原性物質，所以也可用來研究細胞內局部環境的氧化還原狀態。

參考文獻：

Yunyun Ling, Di Zhang, Ximin Cui, Meimei Wei, Ting Zhang, Jianfang Wang,Lehui Xiao, Yunsheng Xia. Direct Monitoring Cell Membrane Vesiculation with 2D AuNP@MnO₂ Nanosheet Supraparticles at Single‐Particle Level. AngewandteChemie International Edition, 2019.

DOI: 10.1002/anie.201902987

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.201902987

作者簡介：

夏云生，安徽師范大學教授。主要研究方向為無機納米粒子自組裝在生物分析中的應用以及納米造影劑與活體成像。國家自然基金委優秀青年科學基金（2014）。

課題組主頁：

http://chem.ahnu.edu.cn/info/1166/7496.htm