非血紅素Fe(II)、α-酮戊二醛（α-KG）依賴性加氧酶是能夠通過形成自由基之后進行一系列串聯反應的酶家族。控制反應的路徑具有較高的價值，并且是擴展生物催化反應的必要步驟和過程。人們開發了許多方法調控FeII/α-KG依賴性酶的反應路線，包括定點突變（site-directed mutagenesis）、DNA改組（DNA shuffling）、位點飽和突變（site-saturation mutagenesis）等方法。
有鑒于此，密歇根大學Alison R. H. Narayan等報道一種新型的序列重構技術，祖先序列重建（ancestral sequence reconstruction，ASR），這種方法能夠對進化信息精確的對控制反應路徑的關鍵基團，隨后通過組合定點突變方法快速的研究其中每個基團的重要性。
本文要點：
（1）
通過DNA改組（DNA shuffling）策略驗證，并且通過量子力學/分子力學（QM/MM）計算模擬驗證。通過這種方法，鑒定了一組活性位點基團，以及反應物和活性位點基團之間的氫鍵作用，對反應路徑起到決定性影響。
（2）
成功的把具有芐基羥基化的現有以及古代酶都改造為能夠進行擴環氧化反應的酶變體，展示了這種ASR技術加快反應路線調控的能力，能夠對具有共同結構和機理特點的家族酶進行工程化的前景。
參考文獻
Di Yang, Chang-Hwa Chiang, Taveechai Wititsuwannakul, Charles L. Brooks III, Paul M. Zimmerman, and Alison R. H. Narayan*, Engineering the Reaction Pathway of a Non-heme Iron Oxygenase Using Ancestral Sequence Reconstruction, J. Am. Chem. Soc. 2024
DOI: 10.1021/jacs.4c08420
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c08420
